[發明專利]GAP啟動子文庫在調節S-腺苷甲硫氨酸代謝途徑中的應用

有效

• 申請號: 201010621230.1
• 申請日: 2010-12-31
• 公開（公告）號: CN102559726A
• 公開（公告）日: 2012-07-11
• 發明（設計）人: 錢江潮;秦秀林;于曉光;儲炬;武曉樂;莊英萍;張嗣良
• 申請（專利權）人: 華東理工大學
• 主分類號: C12N15/63
• 分類號: C12N15/63;C12N15/113;C12N1/19;C12P19/40;C40B40/06;C12R1/84
• 代理公司: 上海專利商標事務所有限公司 31100
• 代理人: 陳靜

技術領域

本發明屬于生物技術領域；更具體地，本發明涉及GAP啟動子在調節S-腺苷甲硫氨酸代謝途徑中的應用。

背景技術

在過去的幾十年里，為了提高微生物發酵產量，越來越多的基因工程手段被應用到代謝工程中。但是大多數情況下，這些嘗試都無法達到預期的效果，有的甚至與預期的結果截然相反。在改造代謝途徑的研究中，為了增加特定目的代謝產物或構建具有過量生產能力且能應用于工業生產的工程菌，常采用過表達限速反應步驟中相關酶和阻斷目的產物分支代謝途徑這兩個傳統的策略。

S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosyl-L-methionine，SAM)作為所有生物體內的重要甲基供體，無論是在抑郁癥，肝臟疾病還是關節炎治療領域都具有良好的臨床應用價值。正因為SAM具備如此廣泛的應用價值，越來越多的研究人員利用代謝工程改變細胞的代謝途徑以獲得高產SAM的菌株。過表達和基因敲除這兩個基因操作手段成功地應用到了SAM高產菌的代謝工程改造中：強化S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因(sam1和sam2)的表達量，提高S-腺苷甲硫氨酸合成酶(MAT)的活性，從而增加SAM的產量；敲除β-胱硫醚合成酶(CBS)基因(cys4)，阻斷SAM和L-Met在細胞內轉化為半胱氨酸的途徑，增加胞內SAM的積累。

野生菌中，MAT酶活是SAM產量提高的限速步驟，提高細胞內部的SAM合成酶的酶活有利于胞內SAM的累積。有兩條途徑可以提高重組菌胞內的SAM合成酶的酶活，即提高胞內SAM合成酶的量或者提高所表達的外源SAM合成酶的比酶活。對于前者，將外源SAM合成酶基因在適合的宿主菌中進行強化表達，通過體外添加L-Met來實現SAM的高產。已有研究者將克隆得到的S.cerevisiae來源的sam2基因置于醇氧化酶-1(AOX1)啟動子調控下，整合至畢赤酵母Pichia?pastoris，獲得了SAM累積量比野生株高30多倍的重組菌。而對于后者，可利用DNA?Shuffling來增強SAM合成酶的酶活。Hu(H.Hu.J.C.Qian.J.Chu.Y.Wang.Y.P.Zhuang.S.L.Zhang.DNA??shuffling?of?methionine?adenosyltransferase?gene?leads?to?improved?S-adenosyl-L-methionine?production?in?Pichia?pastoris.Journal?of?Biotechnology.2009，141：97-103)等為了提高外源SAM合成酶在重組畢赤酵母胞內的活力，以來源不同的三種SAM合成酶基因為出發材料，利用DNA?Shuffling技術對SAM合成酶進行體外進化。經過篩選獲得了一株整合了編碼高酶活SAM合成酶基因的重組畢赤酵母菌株GS115/DS56，在搖瓶中，GS115/DS56的胞內SAM累積量為1.64g/L，SAM合成酶的酶活達到463U/gDCW，比含來源于母本的SAM合成酶的重組菌分別提高了102％和201％，有效改善了胞內SAM合成酶的酶活對SAM合成的限制。然而，Hu等還發現，GS115/DS56胞內的SAM合成酶的酶與出發菌株相比提高了2.8倍，但是SAM的單位菌體產量只提高了13％，胞內SAM合成酶的酶活達到一定水平后，對合成SAM的促進作用十分有限。實驗表明單獨增加限速酶量有時并不有效。在過表達該酶的過程中還可能造成一些細胞生長必需物質的減少，菌體代謝負擔加大，或者是代謝過程所需輔因子的平衡被打破，最終相對于整個代謝網絡而言該途徑的通量是減少的，這也是該方法的缺陷所在。很多研究表明，基因的適度表達比過量表達能達到更好的效果。