[發明專利]一種家蠶濃核病毒BmDNV的PCR快速檢測的方法

有效

• 申請號: 201010617198.X
• 申請日: 2010-12-31
• 公開（公告）號: CN102134612A
• 公開（公告）日: 2011-07-27
• 發明（設計）人: 劉吉平;王永賓
• 申請（專利權）人: 華南農業大學
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68
• 代理公司: 廣州粵高專利商標代理有限公司 44102
• 代理人: 林麗明

技術領域

本發明屬于分子診斷和鑒定技術領域，具體涉及一種快速診斷家蠶濃核病毒及基因組克隆測序分析的方法。

背景技術

家蠶濃核病毒（Bombyx?mori?densovirus，BmDNV）是我國蠶繭生產中普遍發生的病毒病的病毒，嚴重威脅著蠶絲業的持續穩定生產。

二十世紀七十年代初期國外應用血清學方法對家蠶病毒病進行早期診斷。此法能在蠶感病初期（感染病毒后24h～48h）進行確診。我國于七十年代后期正式開始了家蠶病毒病血清學早期診斷的研究。王裕興等（王裕興，曹詒孫，錢元駿等.?酶對流免疫電泳對家蠶濃核病的早期診斷技術.?蠶業科學，1983，9(2):97-102）將免疫酶聯技術應用到該病的早期診斷中，發現酶對流免疫電泳檢測靈敏度比對流免疫電泳提高8倍，最早檢出時間為16?h，半數檢出時間為21h，均比同樣條件下的對流免疫電泳提早8?h左右。錢元俊等（錢元駿，胡雪芳，王紅林.?家蠶病毒病血清診斷實用化研究.?蠶業科學，1984，10(3):155-157）進行了家蠶病毒病血清診斷實用化研究，研制了抗血清濾紙及其干燥保存的條件和方法；郭錫杰等（郭錫杰，錢元駿，胡雪芳.家蠶濃核病的免疫酶組織化學方法早期診斷技術.中國農業科學，1985，(5):82-85）研究了用酶標組化法進行了DNV病的早期診斷；錢元俊等（錢元駿，胡雪芳.家蠶濃核病的血清學診斷方法.蠶業科學，1989，15(4):217-222）進行了多種血清學診斷家蠶濃核病方法的比較研究，包括雙向免疫擴散法（DID）、對流免疫電泳法（CIEP）、酶聯對流免疫電泳法（ELCIEP）、酶標組化法（IEHC）、可溶性酶-抗酶法（PAP）、斑點免疫結合測定法（DIBA）、生物素-親和素系統檢測法（ABS）以及膠乳凝集試驗法（LTA）等，應用這些方法可以檢測出的純化家蠶濃核病毒BmDNV的量為1×10^-1～1×10^-4?OD。以DIBA法檢測靈敏度最高，分別為LAT法的10倍、ELCIEP法的160倍、CIEP法的1000倍。檢測蠶體DNV時，可在接種后8?h～40?h檢出，以ABS法檢出陽性反應最早。

PCR?作為一種新的分子生物學實驗技術，具有靈敏度高、快速特異、操作簡單等優點，對于檢測臨床標本中病原體的核酸序列具有常規診斷方法無可比擬的優勢，在應用于細菌、病毒的診斷與檢測方面已有較多的報道并展示其良好的應用前景。近年來，在運用PCR?技術診斷檢測和研究家蠶濃核病毒基因方面，已經取得了可喜的進展（Kageyasu?S,?Hayakawa?T,?Isawa?H?et?al．Detection?of?the?Silkworm-pathogenic?virus?genomes?by?PCR．Journal?of?Sericultural?Science?of?Japan，1997，66(6):477-483；韓序，姚勤，高路等，家蠶濃核病毒（中國鎮江株）在不同感受性宿主體內的復制.?生物工程學報，2007，23(1):145-151；付艷紅，唐順明，覃光星等.家蠶濃核病毒中國（鎮江）株基因組的克隆及重組質粒轉染家蠶對濃核病毒的拯救.?蠶業科學，2008，34(3):453-458；余蔚，姚勤，郭忠建等.?家蠶濃核病毒中國株非結構蛋白1(NS1)的表達.?微生物學報，2008，48(2):191-196）依據已經報道的家蠶濃核病毒BmDNV基因片段序列設計引物，建立了家蠶濃核病毒BmDNV的PCR診斷方法，但其檢測的敏感性還有待進一步研究。

發明內容

本發明的目的是克服現有家蠶濃核病毒BmDNV檢測技術的不足，提供一種家蠶濃核病BmDNV的PCR快速敏感的檢測方法。

本發明的目的通過以下技術方案予以實現；

提供一種家蠶濃核病BmDNV的PCR快速檢測的方法，包括以下步驟：

（1）提取感染家蠶濃核病毒BmDNV的模板DNA；

（2）設計引物，對提取的家蠶濃核病毒BmDNV的模板DNA進行PCR檢測；