[發明專利]真菌單個孢子的分離方法

無效

• 申請號: 201010617115.7
• 申請日: 2010-12-30
• 公開（公告）號: CN102140432A
• 公開（公告）日: 2011-08-03
• 發明（設計）人: 唐明;孫學廣;陳輝
• 申請（專利權）人: 西北農林科技大學
• 主分類號: C12N3/00
• 分類號: C12N3/00
• 代理公司: 西安集思得知識產權代理有限公司 61210
• 代理人: 張晉吉

技術領域

本發明涉及一種分離方法，具體是對真菌單個孢子的分離方法，屬于微生物培養技術領域。

背景技術

由單個孢子培養得到的純培養物是進行真菌的分離鑒定及基礎生理生化研究的基礎，因而對真菌單個孢子進行分離就顯得尤為重要。目前已有很多用于單孢分離的方法，如利用固定的昆蟲針、眉毛針、玻璃毛細管以及手工制作的玻璃針等工具進行單孢分離。美國科學家Hansen在《Science》1926年64：384“A?simple?method?of?obtaining?single-spore?cultures”公開了一種利用玻璃毛細管進行單孢分離的方法，他用玻璃毛細管吸取含有待分離孢子融化的瓊脂培養基，待培養基固化后在顯微鏡下截取存在單個孢子的毛細管片段用于后續的培養。該方法對實驗技能的要求較高，一方面很難將培養基吸入毛細管中并截取到單個孢子的毛細管片段，另一方面，操作過程中極易引入其他微生物的污染；中國臺灣科學家Goh在《Fungaldiversity》1999年2：47-63“Single-spore?isolation?using?a?hand-made?glassneedle”中報道了一種手工制作的用于單孢分離的玻璃針，可實現對多種真菌孢子的分離和轉移，然而這種方法中玻璃針的制作和使用都比較困難，且極易折斷不便保存；拆榮耀和金敏忠在《植物保護》1991年3：53“介紹一種單孢直接挑取獲得單孢菌株的方法”中借助固定在顯微鏡載物臺上的昆蟲針，實現了對病原菌單孢的分離操作，但該方法的操作比較繁瑣，另外由于昆蟲針較粗且是固定的，缺少靈活性，很難真正挑取并轉移單個的孢子；孫廣宇和張天宇在《植物保護》1996年10(1)：40-41“一種簡易單孢子分離技術”中使用固定在玻璃棒上的尖端彎折的昆蟲針制作了一種挑孢針，雖然這種工具操作比較方便，但仍受限于昆蟲針相對于孢子太粗，不利于實現單個孢子的挑取，且不適合于濕度較大及液體環境中的單孢挑取操作；林代福在《山地農業生物學報》2003年22(5)：462-463“單孢分離的眉毛挑針法”中提出了一種特殊的眉毛挑針，可以很好的實現單孢的分離，但這種方法仍然不適合從液體環境中挑取孢子，同時其制作較為繁瑣且不利于保存。目前為止，雖然用于單孢分離的方法已有很多，但它們在操作、應用及保存上都有一定的局限性，不能針對各種不同的操作環境成功的進行單孢分離。

發明內容

本發明為實現對真菌單個孢子的分離，并克服現行分離方法存在的缺陷，公開了一種簡單實用的單孢分離方法。

本發明是通過以下方法實現的：

a.根據待分離孢子的大小選擇內徑在0.02-1mm之間長度為100mm的硬質中性玻璃毛細管，同時備用尖端細長帶膠頭的玻璃巴斯德吸管以及普通載玻片和蒸餾水，將上述設備及蒸餾水進行高壓蒸汽滅菌；

b.將玻璃毛細管從尖端插入巴斯德吸管中，留一段在巴斯德吸管外，用Parafilm封口膜將巴斯德吸管尖端管口處封閉；

c.用解剖針挑取部分待分離的真菌材料，真菌病害病斑組織或大型真菌菌褶或真菌菌落，置于已消毒的載玻片上，滴加無菌水分散孢子，在復式顯微鏡或解剖鏡下，調整視野使單個孢子清晰可見；

d.將巴斯德吸管的膠頭捏下并保持不動，在復式顯微鏡或解剖鏡下，將毛細管管口接近待分離的單個孢子，并使毛細管管口中心正對并接近孢子，松動膠頭，將孢子吸入毛細管中，保持膠頭不動；

e.取備用的培養基，轉移孢子至培養基上方，捏下膠頭將孢子吹到培養基表面，操作過程中如有污染，便更換玻璃毛細管，操作結束后拆卸玻璃毛細管，將巴斯德吸管與毛細管分別保存，真菌單個孢子的分離完成，培養基選用PDA培養基或SDA培養基或MEA培養基或選擇培養基。

本發明通過將巴斯德吸管和不同規格的玻璃毛細管相結合來實現對各種真菌孢子的吸取和轉移操作。該方法具有造價低、制作及操作簡單，便于拆卸滅菌和可重復利用等特點，同時彌補了目前各種方法均不適合從液體環境中分離真菌孢子的缺陷。

附圖說明

附圖是本發明分離孢子的模式圖。

圖示：巴斯德吸管1，玻璃毛細管2，Parafilm封口膜3，孢子4。

具體實施方式

以下結合附圖對本發明做進一步詳細描述：

a.根據待分離的孢子大小備用內徑為0.1mm、長度為100mm的硬質中性玻璃毛細管若干根，尖端細長帶膠頭的玻璃巴斯德吸管一支，25.4×76.2mm的普通載玻片和20ml蒸餾水，將上述設備及蒸餾水在121℃下高壓蒸汽滅菌20min；