[發明專利]一種負載自體腫瘤相關全抗原的樹突狀細胞疫苗的制備方法

有效

• 申請號: 201010606960.4
• 申請日: 2010-12-27
• 公開（公告）號: CN102091327A
• 公開（公告）日: 2011-06-15
• 發明（設計）人: 蔡建輝;謝紹建;杰夫·梅德因
• 申請（專利權）人: 蔡建輝
• 主分類號: A61K39/00
• 分類號: A61K39/00;C12N5/0784;A61P35/00
• 代理公司: 石家莊匯科專利商標事務所 13115
• 代理人: 王琪

1.一種負載自體腫瘤相關全抗原的樹突狀細胞疫苗的制備方法，其特征在于包括如下工藝步驟：

A、制備自體腫瘤相關全抗原；

B、采取和分離培養DC細胞；

C、用自體腫瘤相關全抗原沖擊DC細胞，使DC細胞成熟并制備成自體腫瘤抗原特異性DC疫苗。

2.根據權利要求1所述的負載自體腫瘤相關全抗原的樹突狀細胞疫苗的制備方法，其特征在于所述的步驟A包括如下工藝步驟：

A1、采用取手術切除、內鏡或穿刺獲得的新鮮腫瘤組織、以及胸腹水離心獲得的新鮮自體腫瘤細胞中的一種，制成自體腫瘤細胞裂解物蛋白；

A2、將步驟A1中的自體腫瘤細胞裂解物蛋白和同源的細胞株裂解物蛋白混合，制備成自體腫瘤相關全抗原。

3.根據權利要求2所述的負載自體腫瘤相關全抗原的樹突狀細胞疫苗的制備方法，其特征在于所述的步驟A1中手術切除、內鏡或穿刺獲得的新鮮腫瘤組織采用如下方法：

取腫瘤周邊部分組織0.3-1.0cm³，剪除周圍非腫瘤組織，慶大霉素-生理鹽水反復洗滌3-5次，剪碎，300目鋼網研磨制備單細胞懸液，反復凍融法制備腫瘤細胞裂解物，過網后蛋白定量備用。

4.根據權利要求2所述的負載自體腫瘤相關全抗原的樹突狀細胞疫苗的制備方法，其特征在于所述的步驟A1中胸腹水離心獲得的新鮮自體腫瘤細胞采用如下方法：

取胸、腹水1500-2000ml，在轉速為1200轉/分鐘條件下離心5分鐘，生理鹽水洗滌離心3次，300目鋼網過網后獲得單細胞懸液，反復凍融法制備腫瘤細胞裂解物，過網后蛋白定量備用。

5.根據權利要求2所述的負載自體腫瘤相關全抗原的樹突狀細胞疫苗的制備方法，其特征在于所述的步驟A2中的自體腫瘤抗原和同源的細胞株抗原混合，制備成自體腫瘤相關全抗原采用如下方法：

反復凍融法制備腫瘤細胞裂解物，過網后蛋白定量，制成同源細胞株裂解物蛋白；將同源細胞株裂解物蛋白與步驟A1中制備的自體腫瘤細胞裂解物蛋白按照質量比為1:1的比例混合，制備成自體腫瘤相關全抗原備用。

6.根據權利要求1所述的負載自體腫瘤相關全抗原的樹突狀細胞疫苗的制備方法，其特征在于所述的步驟B中DC細胞的采取選用外周血直接采取獲得、外周血單狀核細胞分離獲得、通過骨髓造血細胞分離獲得、通過骨髓或其他組織來源的間充質干細胞定向分化獲得、或通過HLA基因半相合或全相合同種異體外周血、外周血單狀核細胞、骨髓造血細胞、間充質干細胞分離或定向分化獲得方法中的一種。

7.根據權利要求6所述的負載自體腫瘤相關全抗原的樹突狀細胞疫苗的制備方法，其特征在于所述的步驟B單狀核細胞采集和分離包括：

B1、單狀核細胞采集前，用GM-CSF?150μg皮下注射，1次/日，行骨髓動員2-3天；

B2、用COBE?SPECTRA細胞成分分離機，按照說明書中“單狀核細胞采集”的設定參數設定程序，外周血循環6000-8000ml，采集單狀核細胞140-160ml；

B3、將步驟B2中的單狀核細胞分裝入50ml離心管，細胞離心機1500轉/分離心5分鐘，收集上層血漿移入50ml離心管，加入質量比為10%葡萄糖酸鈣溶液2.5ml吹打混勻，56℃水浴35分鐘，2500轉/分離心5分鐘，收集上清制備成自體滅活血清，4℃冷藏備用；

B4、收集細胞，30ml生理鹽水稀釋，移入含密度為1.077g/ml的密度梯度淋巴細胞分離液15ml的50ml離心管，應用水平轉頭離心機在2000轉/分鐘的轉速下離心15分鐘，一次性吸管吸取中間白色細胞層即為單狀核細胞；

分別取15ml單狀核細胞移入含40ml生理鹽水的50ml離心管，輕柔吹打混勻，在1500轉/分的轉速下離心10分鐘后棄上清；加入生理鹽水45ml輕柔吹打混勻，在1000轉/分的轉速下離心5分鐘洗滌，棄上清；重復洗滌3次后，加入RPMI-1640培養基，細胞計數；

B5、在75cm³培養瓶加入RPMI-1640無血清培養基20ml，室溫下放置20分鐘行培養瓶活化；將單狀核細胞平均分裝到培養瓶中，細胞濃度控制在1×10⁷個/ml，按體積百分比為10%-20％加入自身血清，于37℃，體積百分比為5%CO₂的飽和濕度培養箱中孵育30-60分鐘取出，移除懸浮細胞和培養液，貼壁細胞即為DC細胞。

8.根據權利要求1所述的負載自體腫瘤相關全抗原的樹突狀細胞疫苗的制備方法，其特征在于所述的步驟C包括如下工藝方法：

在步驟B制備的DC細胞中加入無血清DC培養基20ml，在培養基中按照如下含量添加各種組分：

GM-CSF?500μg/500ml

IL-4?300μg/500ml

慶大霉素2.0萬單位/500ml

其中無血清DC培養基選自美國SIGMA公司或美國BD公司的產品；

將上述培養基置于37℃，體積百分比為5%CO₂的飽和濕度培養箱中擴增培養；第6天加入步驟A制備的自體腫瘤相關全抗原50μg/ml，次日補充體積百分比為10%-15%的自體血清，培養2天后獲取DC疫苗，流式細胞檢測CD80、CD83、CD86、HLA-ABC、HLA-DR表達，鑒定DC疫苗功能。