[發(fā)明專利]貽貝酶解多肽及其制備方法和應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201010610946.1
• 申請(qǐng)日: 2010-12-16
• 公開（公告）號(hào): CN102558296A
• 公開（公告）日: 2012-07-11
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 丁國(guó)芳;楊永芳;黃芳芳;鄭玉寅;李榮;許丹;莊黛娜;楊最素;郁迪;徐銀峰;閆海強(qiáng)
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 浙江海洋學(xué)院
• 主分類號(hào): C07K2/00
• 分類號(hào): C07K2/00;C07K1/20;C07K1/18;C07K1/16;A61K38/01;A61P35/00
• 代理公司: 寧波誠(chéng)源專利事務(wù)所有限公司 33102
• 代理人: 袁忠衛(wèi);景豐強(qiáng)

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種貽貝酶解多肽，本發(fā)明還涉及該貽貝酶解多肽的制備方法及其在抗前列腺癌上的應(yīng)用。

背景技術(shù)

多肽在生物體內(nèi)可作為神經(jīng)遞質(zhì)、白細(xì)胞介素和細(xì)胞生長(zhǎng)因子等活性物質(zhì)，具有維持生物體生長(zhǎng)發(fā)育、免疫調(diào)節(jié)和新陳代謝等活性功能?，F(xiàn)有研究表明，來源于生物體的多肽具有抗腫瘤、抗氧化、抗菌、抗衰老、抗高血壓等活性功能，尤其是抗腫瘤活性已受到各國(guó)研究人員的關(guān)注。目前，有關(guān)天然肽和合成肽的抗腫瘤活性已有大量報(bào)道，并有部分多肽作為抗腫瘤藥物已應(yīng)用于臨床；食物蛋白來源的多肽對(duì)于其抗菌、抗氧化、抗高血壓活性研究頗多，而對(duì)其抗腫瘤活性的相關(guān)報(bào)道較少。

海洋生物蛋白種類繁多，來源廣泛，作為活性肽的一個(gè)重要來源，已受到越來越多的關(guān)注。貽貝作為海洋生物的一個(gè)重要組成部分，隸屬于海洋軟體動(dòng)物門(Mollusca)雙殼綱(Bivalvia)貽貝目(Mytiloida)，在我國(guó)北方稱海紅，江浙稱為淡菜，富產(chǎn)于浙江嵊泗周圍海域。貽貝富含粗蛋白、脂肪和碳水化合物，此外還含有鈣、磷、鐵、維生素等多種微量元素。已有研究表明，貽貝提取物具有抗腫瘤、抗氧化、抗凝、降血壓、降血脂、提高免疫力等活性功能，可參考專利號(hào)為ZL200510110096.8的中國(guó)發(fā)明專利《厚殼貽貝的提取物、制造方法及其用途》(授權(quán)公告號(hào)：CN100467030C)，該專利公開了厚殼貽貝的提取物在流感上的應(yīng)用。類似的還可以參考專利號(hào)為ZL200510024391.1的中國(guó)發(fā)明專利《一種可提高免疫力功能的厚殼貽貝提取物》(授權(quán)公告號(hào)為CN100486593C)；申請(qǐng)?zhí)枮?00910101136.0的中國(guó)發(fā)明專利申請(qǐng)公開《厚殼貽貝脂溶性提取物及其制備方法和用途》(公開號(hào)：CN101606951A)。但至今未見有關(guān)貽貝酶解產(chǎn)物對(duì)前列腺癌細(xì)胞作用的相關(guān)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對(duì)上述的技術(shù)現(xiàn)狀而提供一種貽貝酶解多肽。

本發(fā)明所要解決的又一個(gè)技術(shù)問題是提供一種貽貝酶解多肽的制備方法。

本發(fā)明所要解決的又一個(gè)技術(shù)問題是提供一種貽貝酶解多肽的應(yīng)用。

本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為：一種貽貝酶解多肽，其特征在于包含如下氨基酸序列：

Asp?Leu?Tyr。

本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為：一種貽貝酶解多肽，其特征在于采用如下步驟制備：

①取貽貝肉，制成均漿，調(diào)節(jié)pH值9.5～10，料液比為1∶2～1∶3，添加堿性蛋白酶，加酶量為1500～2000U/g，酶解時(shí)間為6～8小時(shí)，酶解溫度為45～50℃，滅酶后離心，取上層清液；

②將上述的清液經(jīng)過超過濾，收集分子量3K以下的水解液，濃縮并冷凍干燥；

③DEAE-SepharoseFF離子柱交換柱色譜分離，將步驟②中的冷凍干燥后產(chǎn)物通過DEAE-SepharoseFF離子柱交換柱，0.1～1mol/LNaCL梯度洗脫，洗脫速度1～1.5mL/min，蛋白檢測(cè)儀280nm進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)各洗脫峰分別進(jìn)行收集，濃縮后冷凍干燥，將干燥后得到的各個(gè)峰組分采用MTT法進(jìn)行抗腫瘤活性實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步確定目標(biāo)肽所在的洗脫峰，并對(duì)該峰大量收集，濃縮并冷凍干燥；

④采用Sephadex?G-25凝膠柱色譜分離，將步驟③所得的具有最高抗腫瘤活性的冷凍干燥后產(chǎn)物過Sephadex?G-25凝膠柱，流動(dòng)相為蒸餾水，流速為1.5～2mL/min，蛋白檢測(cè)儀280nm進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)各洗脫峰分別進(jìn)行收集，濃縮后冷凍干燥并用MTT法進(jìn)行抗腫瘤活性實(shí)驗(yàn)；

⑤高效液相色譜純化，將步驟④中得到的具有最高抗腫瘤活性冷凍干燥后產(chǎn)后過反相高效液相柱，色譜柱為Zorbax?SB?C₁₈(250mm×9.4mm，5μm)；柱溫為室溫；流動(dòng)相為乙腈和水，梯度洗脫：0～20min，乙腈濃從0％變化到95％，洗脫速度2.5～3.0mL/min，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)280nm。

所述的貽貝酶解多肽在抗前列腺癌上的應(yīng)用。進(jìn)一步，所述的貽貝酶解多肽在抗前列腺癌DU-145細(xì)胞抑制增殖上的應(yīng)用；所述的貽貝酶解多肽在抗前列腺癌PC-3細(xì)胞抑制增殖上的應(yīng)用。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：采用最佳的蛋白酶和優(yōu)選的工藝對(duì)貽貝進(jìn)行酶解純化，將所得的目標(biāo)肽應(yīng)用于抗前列腺癌細(xì)胞上產(chǎn)生了很強(qiáng)的細(xì)胞抑制增殖作用，為抗前列腺癌提供了一條可行性研究途徑；整體工藝簡(jiǎn)單，投入較少，易于推廣應(yīng)用。

附圖說明

圖1為各種蛋白酶的酶解物對(duì)DU-145細(xì)胞增殖抑制率的柱狀圖。