[發明專利]一種基于固相載體上核酸擴增的基因突變檢測方法

有效

• 申請號: 201010608970.1
• 申請日: 2010-12-28
• 公開（公告）號: CN102140509A
• 公開（公告）日: 2011-08-03
• 發明（設計）人: 顏真;包晗;郭晏海;趙錦榮;雷小英;劉永蘭;張菊;梁平
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍第四軍醫大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 西安通大專利代理有限責任公司 61200
• 代理人: 陸萬壽

1.一種基于固相載體上核酸擴增的基因突變檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：

1)針對目的基因的待測區域設計并合成PCR擴增引物對，在擴增引物的5`端增加生物素標記；提取包含目的基因的基因組DNA，以基因組DNA為模板，以生物素標記的擴增引物對進行多個循環的PCR擴增，得到PCR擴增產物；

2)針對目的基因待測區域的突變多態性，設計并合成多個長度為15～25nt的檢測探針，檢測探針上針對檢測突變多態性的位點設置在探針5`端5nt之后；并在檢測探針5`端進行減少空間位阻的序列延長修飾和/或輔助固定修飾；

3)對固相載體的表面進行修飾后，將檢測探針和對照探針呈矩陣分布的固定在固相載體上，得到固定有檢測探針和對照探針的檢測陣列；

4)將PCR擴增產物進行變性處理后，置于包含DNA聚合酶和反應底物的PCR反應液中，然后再加入檢測陣列，進行固相核酸擴增反應；其反應程序為：A：在不低于探針Tm值5℃的溫度下退火至少10s；B：72℃延伸至少10s；A-B循環數至少大于1；最后72℃延伸至少3min；

5)固相核酸擴增完成后，取出檢測陣列放入洗脫液中離心洗脫，去除非特異核酸的結合，用含親和素-堿性磷酸酶的反應液覆蓋檢測陣列并進行孵育，再次洗脫后用ddH₂O沖洗，最后覆蓋包含NBT和BCIP的顯色液進行顯色，直至看到顯色斑點后用ddH₂O終止反應；

6)顯色斑點相對應的檢測探針上的檢測位點與目的基因的待測區域相匹配，未顯色斑點相對應的檢測探針上的檢測位點與目的基因的待測區域不相匹配；根據設計的檢測探針及其陣列上的檢測位點設計情況，對待測區域的突變多態性進行判讀。

2.如權利要求1所述的基于固相載體上核酸擴增的基因突變檢測方法，其特征在于，所述的以基因組DNA為模板的PCR擴增，擴增循環數為25～40，所擴增的片段長度不超過1000bp。

3.如權利要求1所述的基于固相載體上核酸擴增的基因突變檢測方法，其特征在于，所述的檢測探針包括多個針對檢測突變多態性的位點，同一陣列上分布的探針的Tm值相差不超過2℃。

4.如權利要求1所述的基于固相載體上核酸擴增的基因突變檢測方法，其特征在于，所述的進行減少空間位阻的序列延長修飾是在檢測探針5`端進行polyT、polyC、polyT+polyC或spacer?6～15C序列的延長修飾；

所述的固相載體為硝酸纖維素膜、尼龍膜或載玻片，檢測探針5`端的輔助固定修飾為在檢測探針5`最末端添加氨基、巰基、羥基或醛基。

5.如權利要求1所述的基于固相載體上核酸擴增的基因突變檢測方法，其特征在于，所述的固相載體為硝酸纖維素膜或尼龍膜，將硝酸纖維素膜或尼龍膜在SSC溶液中浸泡30～60min后在35～40℃條件下干燥，然后再將檢測探針和對照探針均勻噴涂在硝酸纖維素膜或尼龍膜上，經50～80℃干燥30～120min，紫外光照1～10min后，得到固定有檢測探針和對照探針的硝酸纖維素或尼龍膜的檢測陣列。

6.如權利要求1所述的基于固相載體上核酸擴增的基因突變檢測方法，其特征在于，所述的對照探針包括陰性對照探針和陽性對照探針，其所設計的序列均與待檢測的序列無互補性，陽性對照探針的5`端還被生物素標記。

7.如權利要求1所述的基于固相載體上核酸擴增的基因突變檢測方法，其特征在于，所述的檢測陣列在使用前還在體積濃度為2％～5％的BSA中37℃封閉至少15min。

8.如權利要求1所述的基于固相載體上核酸擴增的基因突變檢測方法，其特征在于，所述的變性處理為熱變性處理：95℃以上至少放置5min，再在0℃至少放置3min；

或者，所述的變性處理為堿變性處理：將質量濃度10％的NaOH溶液與PCR擴增產物按照1∶10～20的體積比混合，放置至少3min。

9.如權利要求1所述的基于固相載體上核酸擴增的基因突變檢測方法，其特征在于，所述的進行固相核酸擴增反應，其反應體系為40～200μl，包括變性處理后的PCR擴增產物，含DNA聚合酶、反應底物和Mg²⁺的PCR反應液，以及ddH₂O；加入的檢測陣列浸沒于反應體系內。

10.如權利要求1所述的基于固相載體上核酸擴增的基因突變檢測方法，其特征在于，所述的固相核酸擴增反應完成后，取出檢測陣列首先放入洗脫液A中，轉速至少30rpm離心洗脫至少1min；然后將檢測陣列覆蓋親和素反應液后37℃孵育至少10min后，再依次放入洗脫液A、洗脫液B中，轉速至少30rpm離心洗脫至少1min；取出檢測陣列用ddH₂O沖洗，最后覆蓋顯色液進行顯色，至看到顯色斑點后終止反應；

所述的洗脫液A的組成為100mmol/L?pH＝7.5的Tris-Cl、300mmol/L?NaCl和4mmol/L?Mg₂Cl；洗脫液B的組成為100mmol/L?pH＝9.5的Tris-Cl、300mmol/L?NaCl和4mmol/L?Mg₂Cl；

所述的親和素反應液組成為1mL?ddH₂O和2μl親和素-堿性磷酸酶液；顯色反應液組成為1mL顯色緩沖液、6.5μlNBT合3.5μl?BCIP。