[發(fā)明專利]用于檢測(cè)酒精性肝病易感性的試劑盒

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201010600143.8
• 申請(qǐng)日: 2010-12-22
• 公開（公告）號(hào): CN102146438A
• 公開（公告）日: 2011-08-10
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 韓俊領(lǐng);劉志霈;周毓玲;杜宏偉;李楠;靳霞;劉蓉華
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 協(xié)和干細(xì)胞基因工程有限公司;天津?yàn)I海協(xié)和基因科技有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68
• 代理公司: 天津才智專利商標(biāo)代理有限公司 12108
• 代理人: 王曉紅

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種疾病易感性檢測(cè)用的試劑盒，尤其是一種檢測(cè)酒精性肝病易感性的試劑盒，通過(guò)檢測(cè)ADH2、ALDH2、CYP2E1的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)(SNP)，來(lái)預(yù)測(cè)個(gè)體對(duì)白血病的易感性。

背景技術(shù)

酒精性肝病(alcoholic?liver?disease，ALD)是由于長(zhǎng)期飲酒導(dǎo)致的肝損害，表現(xiàn)為3種形式，即酒精性脂肪肝、酒精性肝炎、酒精性肝硬化。這三種形式可單獨(dú)或混合存在。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全世界約有1500萬(wàn)-2000萬(wàn)人酗酒，其中約10％-20％(150萬(wàn)～400萬(wàn))有不同程度的酒精性肝病。在我國(guó)，隨著人民生活水平的不斷提高，經(jīng)濟(jì)條件的改善，近年來(lái)ALD的發(fā)病率也呈逐年上升趨勢(shì)，酒精已成為繼病毒之后導(dǎo)致肝損傷的第二大原因。

飲酒后乙醇主要在小腸吸收，其中90％～95％在肝內(nèi)代謝。乙醇在肝臟內(nèi)被胞質(zhì)內(nèi)的ADH和微粒體內(nèi)的CYP2EI為主的微粒體乙醇氧化系統(tǒng)分解為乙醛。在通常情況下，以ADH為主起作用；而慢性習(xí)慣性飲酒者攝入酒精后則誘導(dǎo)CYP2EI，乙醇由CYP2EI進(jìn)行代謝。生成的乙醛，主要經(jīng)過(guò)ALDH代謝為乙酸，后者進(jìn)入三羧酸循環(huán)，代謝為二氧化碳和水。ADH、ALDH和CYP2EI均有遺傳多態(tài)性，不同基因個(gè)體表達(dá)的酶活性不同，因而影響機(jī)體對(duì)乙醇的敏感性。

迄今為止，ADH已明確有7種同工酶(ADH1～7)，其中ADH2在肝臟的酒精代謝過(guò)程中起著重要的作用。人類ADH2基因位于4號(hào)染色體，有3個(gè)等位基因：ADH2*1型等位基因在歐美血統(tǒng)人群中最為常見，其表達(dá)產(chǎn)物缺乏乙醇脫氫酶活性，誘導(dǎo)代謝乙醇的能力較低；ADH2*2型等位基因最常見于亞洲血統(tǒng)人群，其表達(dá)產(chǎn)物的生物活性是ADH2*1的40倍，因此具有ADH2*2基因型酶的個(gè)體代謝乙醇的速度快。ADH2*3僅見于非洲血統(tǒng)的人群。ADH2*2基因型個(gè)體乙醇代謝速度較快，容易引起其代謝產(chǎn)物乙醛的蓄積，體內(nèi)過(guò)量的乙醛不僅可以直接損害肝細(xì)胞，導(dǎo)致脂肪在肝細(xì)胞內(nèi)堆積，還可以通過(guò)激活Kupffer細(xì)胞生成大量細(xì)胞因子而引起炎癥。

人類ALDH基因家族中有12個(gè)成員，其中ALDH2是和嗜酒密切相關(guān)并具有多態(tài)性的主要代謝酶，在亞洲人群有高度遺傳多態(tài)性。ALDH2基因位于染色體12q24.2，有2個(gè)等位基因ALDH2*1和ALDH2*2。ALDH2*1為野生型，表達(dá)產(chǎn)物具有生物活性，而ALDH2*2基因型在第12外顯子出現(xiàn)堿基替換(G→A)導(dǎo)致ALDH2第487位發(fā)生谷氨酸和賴氨酸的替換，從而使ALDH2喪失酶活性，使乙醛在體內(nèi)蓄積，體內(nèi)過(guò)量的乙醛會(huì)增加ALD的患病風(fēng)險(xiǎn)。

微粒體乙醇氧化系統(tǒng)是一組混合功能的氧化酶系，其催化作用有賴于細(xì)胞色素P450的參與，其中CYP2EI與酒精代謝密切相關(guān)，被認(rèn)為是酒精性肝病的易感基因。CYP2EI基因位于人類第10號(hào)染色體上，長(zhǎng)11413bp，包括9個(gè)外顯子和8個(gè)內(nèi)含子。CYP2EI基因存在6種限制性內(nèi)切酶片段長(zhǎng)度多態(tài)性：Tap?I、Rsa?I、Dra?I、Msp?I多態(tài)以及5’-端調(diào)控區(qū)的Rsa?I和Pst?I多態(tài)。其中位于-1019bp位點(diǎn)的5’-端調(diào)控區(qū)Rsa?I位于轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合區(qū)域，可能影響基因表達(dá)，當(dāng)發(fā)生點(diǎn)突變C→T時(shí)，導(dǎo)致肝臟CYP2EI的轉(zhuǎn)錄增加，從而促進(jìn)乙醇代謝，產(chǎn)生損傷肝臟的活性氧物質(zhì)，與酒精性肝損害有關(guān)。

現(xiàn)有技術(shù)檢測(cè)酒精性肝病易感人群，采用雜交芯片法或玻璃板芯片法，以及利用taqman探針，該方法準(zhǔn)確率低、假陰性和假陽(yáng)性率較高，且不能批量檢測(cè)；另一種直接測(cè)序法，雖準(zhǔn)確率高，但其成本高、同樣不能實(shí)現(xiàn)批量檢測(cè)，因此現(xiàn)有方法均無(wú)法滿足大規(guī)模基因篩選的要求。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是，通過(guò)檢測(cè)一組與酒精性肝病易感性相關(guān)的基因及位點(diǎn)，利用特異性引物和探針，通過(guò)單核苷酸延伸技術(shù)結(jié)合微陣列芯片技術(shù)，綜合檢測(cè)和分析受檢人群是否攜帶“酒精性肝病易感基因”，將酒精性肝病易感人群從人群中篩選出來(lái)，改變不良的生活習(xí)慣，達(dá)到預(yù)防的目的。

為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：一種用于檢測(cè)酒精性肝病易感的檢測(cè)試劑盒，它包括與酒精性肝病關(guān)系密切的三個(gè)基因的組合：乙醇脫氫酶的ADH2基因、乙醛脫氫酶的ALDH2基因和細(xì)胞色素P4502E1的CYP2E1基因。

包括下述SNP位點(diǎn)：ADH2基因的rs1229984位點(diǎn)、ALDH2的rs671位點(diǎn)和CYP2E1的rs2031920位點(diǎn)。

所述的用于檢測(cè)酒精性肝病易感的基因組合，用于針對(duì)所述位點(diǎn)設(shè)計(jì)特異性的引物對(duì)和探針。