[發明專利]綿羊IFN-γ誘導的溶酶體巰基還原酶cDNA及其克隆方法和重組應用

有效

• 申請號: 201010598400.9
• 申請日: 2010-12-21
• 公開（公告）號: CN102121021A
• 公開（公告）日: 2011-07-13
• 發明（設計）人: 張雙全;艾洪新;張真真
• 申請（專利權）人: 南京師范大學
• 主分類號: C12N15/53
• 分類號: C12N15/53;C12N15/10;C12N15/09;A61K39/00;A61P37/04;C12N9/02
• 代理公司: 南京知識律師事務所 32207
• 代理人: 盧亞麗

技術領域

本發明涉及生物基因工程領域，具體涉及綿羊IFN-γ?誘導的溶酶體巰基還原酶cDNA及其克隆、表達技術。

背景技術

GILT（γ-干擾素誘導的溶酶體巰基還原酶）是1988年由Luster等人發現的。GILT是以可溶性糖蛋白前體的形式被甘露糖-6-磷酸受體傳遞到胞吞途徑后，N-和C-端前肽被切割形成30KDa成熟形式。以Ⅱ型組織相容性抗原復合物（MHC?classⅡ）為基礎的抗原呈遞需要將天然蛋白加工成短肽以適合MHC的結合和T細胞受體（TCR）的識別。抗原呈遞細胞中進行的抗原抗原的變性、去折疊、二硫鍵還原及蛋白水解。在整個加工途徑中，二硫鍵的還原是關鍵步驟。30kDa?GILT具有催化二硫鍵還原的活性,因此能夠促進天然蛋白抗原的去折疊和進一步的蛋白酶解。GILT在抗原呈遞細胞組成型表達，在成纖維細胞、內皮細胞和角蛋白細胞等細胞中可被IFN-γ誘導表達。在專門的抗原呈遞細胞如B細胞和巨噬細胞中，?GILT在較低的pH條件下有較高的活性，并且被證明在抗原加工及免疫顯性表位的顯示中起著重要的作用。此外，GILT?在中和胞外的病原體和清除感染的細胞碎片方面也有作用。GILT?的缺失可能影響到對病毒、腫瘤、細菌、寄生蟲抗原的免疫應答，并且可能影響自身免疫變態反應性腦脊髓炎（experimental?allergic?encephalomyelitis）、糖尿病的發生發展。

目前國內對GILT?的研究較少，只獲得了豬、文昌魚、石斑魚、大黃魚、珍珠貝的GILT基因并對用real-time?PCR技術對GILT的表達分布進行鑒定，通過LPS刺激檢測GILT表達量的變化情況。

國外關于人、鼠GILT的研究進展：

（1）Patrick等人研究表明人的黑色素瘤細胞中GILT的表達依賴于STAT1而不依賴于CIITA。表達MHC?classII的腫瘤細胞不總是與GILT的表達相偶聯，這是因為IFN-γ刺激細胞表面受體使其胞內酪氨酸殘基磷酸化，這些磷酸化的酪氨酸殘基成為STAT1單體的停泊位點，從而被Jak1和2磷酸化。磷酸化的STAT1二聚化入核激活一系列靶基因的轉錄包括CIITA。而CIITA是MHC?classII的總開關，它的缺失不影響GILT的表達。

（2）Maric等人的研究表明GILT的上調會降低T細胞的敏感性從而減少自身免疫。降低成熟T細胞的TCR的敏感性有助于控制自身免疫病的發生。GILT-/-的外周T細胞能夠增加TCR的敏感性，因為降低了線粒體超氧化物歧化酶的表達導致活性氧的增加和ERK1/2的磷酸化。GILT-/-?T細胞的敏感性增加導致了高血糖癥。

（3）、2010年Reshma?Singh和Peter?Cresswell在Science上發表文章證明GILT對促進I型組織相容性抗原復合物的呈遞抗原有作用，在GILT-/-小鼠中缺乏對病毒抗原的交叉遞呈，影響了CD8+T細胞對病毒抗原的應答反應。

（4）、Su?Yan等人研究表明GILT?對B細胞的耐受起重要作用，臨床免疫耐受誘導方面有潛在價值。肽-IgG融合蛋白轉導的脾臟B細胞能夠有效的對APCs（抗原呈遞細胞）耐受。但是機制如何并不清楚。他們發現來源于肽-IgG的class?II表位以GILT依賴的方式被加工。這種體內耐受誘導系統對多種自身免疫病（實驗性變態反應性腦脊髓炎、糖尿病、血友病）模型動物有效。

（5）、Reshma?Singh等在nature的文章表明GILT?是李斯特氏菌感染的關鍵宿主因子。李斯特氏菌是革蘭氏陽性、胞內、食源性病原菌能夠在人和動物體內引起嚴重的疾病。感染過程中被巨噬細胞吞噬并在胞內逃離吞噬體并在胞漿中復制，然后以非裂解的機制從一個細胞到另一個細胞傳播。穿透吞噬體膜是通過分泌溶血素（LLO）實現的。活化具有裂解活性的LLO的正是GILT。在細菌感染部位，巨噬細胞能夠分泌GILT到胞外，GILT因能夠活化那個部位的血溶素介導的組織破壞，可能包括因宿主防御招募過來的炎癥細胞的裂解。

綜上所述,國際上對GILT的研究是個熱點，但對GILT上游的基因調控及下游信號通路與免疫調節機理研究比較充分，但應用研究還是一個空白，本課題基于國內外研究的現狀以及羊的細菌感染疾病的思考提出，對羊GILT進行分子結構、功能及免疫調節機制方面進行研究，針對免疫力低下和炎癥感染疾病的動物，開發相關的免疫增強劑和疫苗佐劑。

發明內容