[發明專利]一種H9亞型禽流感病毒檢測試劑盒及其應用

無效

• 申請號: 201010598148.1
• 申請日: 2010-12-21
• 公開（公告）號: CN102121057A
• 公開（公告）日: 2011-07-13
• 發明（設計）人: 吳文學;蔣菲;黃書林;張躍偉
• 申請（專利權）人: 中國農業大學
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 關暢;任鳳華

技術領域

本發明涉及一種H9亞型禽流感病毒檢測試劑盒及其應用。

背景技術

禽流感是由正黏病毒科流感病毒屬的禽類A型流感病毒(Influenza?A?virus)引起的一類禽類烈性傳染病。根據血凝素與神經氨酸酶的抗原性不同，可分為16個H亞型(H1-H16)和9個N亞型(N1-N9)。1966年在美國首次分離到H9亞型禽流感病毒，隨后中國大陸、香港、韓國、中東、歐洲以及北美等國家和地區均有報道。中國大陸自1994年首次分離到H9亞型禽流感病毒后，開始廣泛流行，對養禽業造成一定的經濟損失。

家禽感染H9亞型禽流感病毒，特別當伴有混合感染時，可導致病禽高死亡率及產蛋率嚴重下降。有文獻報道香港曾從患有流感的兒童體內分離出H9N2禽流感病毒。因此，該病不僅對養禽業有較大危害，而且威脅著人類健康。

目前已有多種方法用于H9亞型禽流感病毒的檢測，大致可以分為病原學、血清學以及分子生物學三類。病原學方法主要包括組織學診斷、動物接種試驗和細胞培養法。血清學方法主要包括瓊脂免疫擴散試驗(AGID)、血液凝集試驗(HA)、血液凝集抑制試驗(HI)和酶聯免疫吸附試驗(ELISA)。分子生物學方法組要包括各種反轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)、反轉錄實時PCR(real-time?PCR)、核酸恒溫擴增法(nucleic?acid?sequence-based?amplification，NASBA)等。上述方法均存在不同的缺點，如操作復雜、費時、設備昂貴等缺點，不適于基層應用。

發明內容

本發明的目的是提供一種H9亞型禽流感病毒檢測試劑盒及其應用。本發明提供的試劑盒基于反轉錄環介導等溫擴增(Reverse?transcriptase?loop-mediated?isothermal?amplification，RT-LAMP)技術，可以快速檢測H9亞型禽流感病毒。

本發明提供了檢測H9亞型禽流感病毒的專用引物，由以下三對環介導等溫擴增所用引物組成；一對引物是與H9亞型禽流感病毒的HA基因(GenBank?Accession?Number?EU644482)結合的內側引物對，一對引物是與H9亞型禽流感病毒的HA基因(GenBank?Accession?Number?EU644482)結合的外側引物對，一對引物是與H9亞型禽流感病毒的HA基因(GenBank?Accession?Number?EU644482)結合的環形引物對。

H9亞型禽流感病毒的HA基因的核苷酸序列具體可如序列表的序列1所示(GenBank?Accession?Number?EU644482)。

所述內側引物對由上游引物FIP和下游引物BIP組成，所述上游引物FIP的核苷酸序列具體可為序列表中的序列4，所述下游引物BIP的核苷酸序列具體可為序列表中的序列5；所述外側引物對由上游引物F3和下游引物B3組成，所述上游引物F3的核苷酸序列具體可為序列表中的序列2，所述下游引物B3的核苷酸序列具體可為序列表中的序列3；所述環形引物對由上游引物LF和下游引物LB組成，所述上游引物LF的核苷酸序列具體可為序列表中的序列6，所述下游引物LB的核苷酸序列具體可為序列表中的序列7。

應用所述專用引物檢測H9亞型禽流感病毒的原理如下：

根據H9亞型禽流感病毒的HA基因設計一組用于反轉錄環介導等溫擴增的引物，即內側引物對(上游引物FIP和下游引物BIP)、外側引物對(上游引物F3和下游引物B3)和環形引物對(上游引物LF和下游引物LB)。三對引物和H9亞型禽流感病毒HA基因序列保守區的八個特定區域的序列完全配對(見表1)，可以確保反應的徹底進行，也保證了檢測方法的特異性。由于引物識別的8個區域是通過比對最近幾年所有H9亞型禽流感病毒的HA基因(包括H9N1至H9N9)尋找出的保守區，所以所述專用引物能特異性的識別所有H9亞型的禽流感病毒。

表1專用引物與H9亞型禽流感病毒的HA基因的結合區域

所述專用引物在AMV反轉錄酶和具有鏈置換活性Bst?DNA聚合酶的作用下可完成對模板RNA的擴增。擴增過程分為三個階段，具體如下：

(1)反轉錄階段

在AMV反轉錄酶的作用下，樣本RNA被反轉錄為cDNA。

(2)循環起始階段