[發(fā)明專利]月季RcLEA編碼序列及其應(yīng)用

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201010591786.0
• 申請日: 2010-12-16
• 公開（公告）號: CN102094028A
• 公開（公告）日: 2011-06-15
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 胡永紅;蔣昌華;明鳳;張璇
• 申請（專利權(quán)）人: 上海植物園;復(fù)旦大學(xué)
• 主分類號: C12N15/29
• 分類號: C12N15/29;C07K14/415;C12N15/70;C12N1/21;C12Q1/68;C12R1/19
• 代理公司: 上海正旦專利代理有限公司 31200
• 代理人: 陸飛;盛志范

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于分子生物學(xué)以及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種在月季中表達(dá)的RcLEA（月季胚胎發(fā)育后期豐富蛋白，Rosa?chinensis?late-embryogenesis-abundant?protein，RcLEA）蛋白基因的克隆，基因表達(dá)模式分析，轉(zhuǎn)基因載體的構(gòu)建，大腸桿菌的轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)基因菌株的獲得及其非生物脅迫耐性的鑒定。

背景技術(shù)

由于“溫室效應(yīng)”現(xiàn)象日益明顯，全球氣溫持續(xù)升高，夏季高溫已成為制約植物生長和發(fā)育的主要環(huán)境因子，植物生長發(fā)育面臨高溫逆境的嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。胚胎發(fā)育后期豐富蛋白(LEA)是生物體中廣泛存在的一類與滲透調(diào)節(jié)有關(guān)的家族蛋白。研究發(fā)現(xiàn)在植物胚胎發(fā)育晚期，LEA蛋白表達(dá)量十分豐富，而且在環(huán)境脅迫如干旱、低溫、鹽脅迫、ABA、紫外輻射和NaHCO3等條件下LEA蛋白mRNA也會大量累積，被認(rèn)為是在脅迫過程中對植物起保護(hù)作用的物質(zhì)之一。LEA蛋白在細(xì)胞中分布廣泛，具有很高的親水性和熱穩(wěn)定性，即使在煮沸條件下也能保持水溶狀態(tài)，起穩(wěn)定細(xì)胞膜、分子屏障、離子結(jié)合和防止氧化等作用。

在沒有脅迫或激素處理的條件下，擬南芥中的一些LEA基因表現(xiàn)出組成型表達(dá)特性；在干旱、冷和鹽脅迫條件下，部分LEA基因可被脅迫強烈誘導(dǎo)表達(dá)。月季RcLEA基因為熱激誘導(dǎo)表達(dá)，但在高溫脅迫條件下，RcLEA只在耐熱月季品種中強表達(dá)，而在不耐熱品種中弱表達(dá)甚至不表達(dá)，該基因的表達(dá)與否與月季品種的田間耐熱性差異觀察結(jié)果相吻合。

大豆LEA蛋白Em的表達(dá)可提高大腸桿菌和轉(zhuǎn)基因煙草的耐鹽性，自1981?年Dure等在棉花子葉中報告LEA?蛋白以來,?在許多植物的種子、花粉粒和受干旱脅迫的幼苗營養(yǎng)組織中,?發(fā)現(xiàn)LEA?蛋白可高水平表達(dá),?且表達(dá)水平與植物細(xì)胞的抗逆性有著密切的關(guān)系.?目前關(guān)于LEA蛋白的抗脅迫研究已經(jīng)積累了一些資料.?如Cheng等將小麥PMA1959?(LEA1?)基因轉(zhuǎn)化水稻,?使轉(zhuǎn)基因水稻的脫水耐鹽能力得到增強。利用酵母細(xì)胞與植物細(xì)胞在一些耐鹽反應(yīng)上的相似性；?Swire-Clark將小麥Em?基因(LEA1)?轉(zhuǎn)化酵母,?證明了單一LEA蛋白在提高重組酵母對高濃度NaCl、KCl和低溫脅迫的耐受性中起著直接作用。蔡丹等（2006）將大豆Em基因(LEA1)?轉(zhuǎn)化大腸桿菌和煙草,?證明了大豆Em?蛋白的過量表達(dá)不僅對提高重組菌耐鹽性有著直接的貢獻(xiàn),?也可提高轉(zhuǎn)基因煙草對高鹽脅迫的耐受性.?這一結(jié)果與前人在水稻和酵母中得到的結(jié)果一致,?為前人提出的假說,?即“LEA蛋白在原核生物和真核細(xì)胞中可能采取相似的抗逆保護(hù)機制”提供了實驗證據(jù),?也表明大腸桿菌異源表達(dá)體系是研究LEA蛋白耐鹽機制的簡單、快捷、有效的體系.。

隨著生活水平的提高，園林觀賞植物越來越受到人們關(guān)注，研究觀賞植物對溫度逆境抗性的遺傳機制有廣泛的應(yīng)用前景。

本發(fā)明研究了一種從月季中克隆的胚胎發(fā)育后期豐富蛋白基因，轉(zhuǎn)入大腸桿菌后提高轉(zhuǎn)基因菌株對高溫、低溫及其它非生物脅迫耐性的技術(shù)，應(yīng)用該技術(shù)不僅可以提高原核生物的溫度抗性，而且預(yù)期可以提高轉(zhuǎn)基因植物的溫度抗性。

在本發(fā)明被公布之前，尚未有任何公開或報道過本發(fā)明申請中提及的月季RcLEA序列及其核酸序列。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的第一目的就是提供一種新的月季基因RcLEA(SEQ?ID?NO.1)，該基因是一個胚胎發(fā)育后期豐富蛋白基因。

本發(fā)明的第二目的是提供這種月季胚胎發(fā)育后期豐富蛋白RcLEA編碼序列在利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)提高大腸桿菌對多種非生物脅迫耐受性的應(yīng)用。

本發(fā)明一方面從月季分離出了一種DNA分子，其核苷酸序列見SEQ?ID?NO.1所示。它是一種胚胎發(fā)育后期豐富蛋白基因，該基因長度為981bp。

本發(fā)明另一方面得到了一種蛋白質(zhì)分子，它編碼具有SEQ?ID?NO.2所示的氨基酸序列的多肽，由326個氨基酸殘基組成，分子量為36068.98道爾頓，pI為4.526。

本發(fā)明還提供了一種檢測RcLEAmRNA表達(dá)模式的方法，其步驟如下：

（1）耐熱性能差異顯著的兩個月季品種二年生嫁接苗于25℃常溫及38℃熱激處理2.5—3.5小時，分別提取它們嫩葉的總RNA(植物RNAout試劑盒，市售)。

（2）利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（市售）將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后根據(jù)RcLEA的開放讀框的第1-20，962-981的特異序列設(shè)計引物，進(jìn)行PCR。