[發明專利]一種豇豆胰蛋白酶抑制劑基因、及其應用、大量制備豇豆胰蛋白酶抑制劑的方法

無效

• 申請號: 201010590327.0
• 申請日: 2010-12-08
• 公開（公告）號: CN102127552A
• 公開（公告）日: 2011-07-20
• 發明（設計）人: 高偉;李峰;陸慶宇
• 申請（專利權）人: 北京林業大學
• 主分類號: C12N15/29
• 分類號: C12N15/29;C07K14/415;C12N15/63;C12N15/09;C12P21/02;C12N1/21;C12R1/19
• 代理公司: 北京法思騰知識產權代理有限公司 11318
• 代理人: 高宇;楊小蓉

技術領域

本發明涉及基因工程領域，具體地，本發明涉及一種豇豆胰蛋白酶抑制劑基因、及其應用、大量制備豇豆胰蛋白酶抑制劑的方法。

背景技術

豇豆胰蛋白酶抑制劑(cowpea?trypsin?inhibitor，CPTI)是一種屬于Bowman-Birk家族的絲氨酸蛋白酶抑制劑，可以與農業害蟲(主要是鱗翅目、直翅目、鞘翅目昆蟲)消化道中的絲氨酸蛋白酶形成酶-抑制劑的復合物，從而減弱或阻斷蛋白酶的消化水解作用，進而使害蟲產生營養不良，出現機能紊亂甚至死亡現象。與傳統的Bt蛋白相比，CPTI蛋白具有抑蟲或殺蟲譜更廣、對人畜安全等優點，是一種生物農藥的潛在開發對象，因而在農林業具有很高的應用和推廣價值。

大腸桿菌表達體系是目前應用最廣泛的原核表達體系，主要由表達載體和宿主菌兩部分組成。表達載體一般具有以下特征：穩定的遺傳復制、傳代能力；具有篩選標記；可調控的啟動子，抑制時本底轉錄水平較低；具備外源基因插入的多克隆位點。宿主菌一般選擇蛋白酶缺陷的菌株，如經典的BL21系列菌株就是lon和ompT蛋白酶缺陷型。

但是并非所有外源基因在大腸桿菌表達系統中都能高效表達，本發明的發明人發現從豇豆中克隆得到的豇豆胰蛋白酶抑制劑不能在大腸桿菌中高效表達，其表達量較低，表達的蛋白活性較低。

發明內容

為了解決上述問題，本發明的發明人提出并完成了本發明。

本發明的目的是提供一種豇豆胰蛋白酶抑制劑基因。

本發明的再一目的是提供一種豇豆胰蛋白酶抑制劑。

本發明的另一目的是提供一種豇豆胰蛋白酶抑制劑原核表達載體。

本發明的另一目的是提供一種高效、大量表達豇豆胰蛋白酶抑制劑的方法。

本發明的另一目的是提供一種高效、大量表達豇豆胰蛋白酶抑制劑的基因工程菌株。

本發明的另一目的是提供上述豇豆胰蛋白酶抑制劑基因的應用。

如上所述本發明的發明人首先利用PCR反應從豇豆基因組DNA中直接獲得CPTI基因(CPTI基因不含有內含子)，CPTI基因的開放閱讀框編碼106個氨基酸，該編碼蛋白N端帶有一個18個氨基酸的信號肽(SignalP：http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)。將該基因在大腸桿菌中表達，發現其表達量較低，表達的蛋白活性較低。

由于原核表達體系通常不具有識別真核細胞信號肽并將該蛋白成功定位的功能，而成熟有活性的蛋白總是在信號肽酶切除信號肽后才能形成，同時信號肽主要含疏水性氨基酸，在原核表達體系中大量表達時常常形成包涵體。因此，本發明的發明人在表達上述CPTI基因時去除了部分信號肽序列，同時優化了序列按照盡可能的去掉信號肽序列、又要保證不破壞蛋白的二級結構的原則，把基因前30個脫氧核糖核苷酸去除，利于在大腸桿菌中表達出該基因的重組蛋白。然后將改造優化的CPTI基因的編碼序列構建到原核表達載體PGEX-6p-1中；隨后將構建好的CPTI表達載體轉化到表達菌株BL21(DE3)中，用誘導劑IPTG(isopropyl-β-d-1-thiogalactopyranoside，異丙基-β-d-硫代半乳糖苷)誘導融合蛋白的表達；利用融合蛋白的GST標簽可以與Glutathione?Sephrose?4B親和的特性，可以純化得到純度達到90％以上的融合蛋白GST-CPTI。

優化后CPTI基因的序列如SEQ?ID?No.1所示：

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根據本發明的豇豆胰蛋白酶抑制劑，其由核苷酸序列如SEQ?ID?No.1所示的基因編碼，具體地，其具有如SEQ?ID?No.2所示的氨基酸序列。