[發明專利]一種用HPLC測定納豆激酶純度的方法

無效

• 申請號: 201010553845.5
• 申請日: 2010-11-17
• 公開（公告）號: CN102465169A
• 公開（公告）日: 2012-05-23
• 發明（設計）人: 謝明利;張云峰;陳曉煒;胡伶俐
• 申請（專利權）人: 湖北國力生物技術開發有限公司
• 主分類號: C12Q1/48
• 分類號: C12Q1/48
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及一種高效液相測定納豆激酶純度的方法，屬于分析檢測領域。

背景技術

納豆激酶作為新一代溶栓藥物，具有藥理作用直接且多元化、體內半衰期長、分子量相對較小，可直接通過胃腸系統被人體吸收、安全性高、價格便宜等諸多優點。此外，納豆激酶還可以調節體內其他酶的活性以進一步加強溶栓效果，因此，納豆激酶具有良好的開發成為新一代溶栓藥物的潛力。

關于納豆激酶純度的測定方法通常采用電泳法，該法無法進行定量檢測，也無法測定產品的具體純度，為納豆激酶精制及其藥物的工業化生產帶來很大障礙。目前未見文獻報道有關于納豆激酶純度測定的有效方法，致使納豆激酶的產品仍然停留在保健食品的階段，而納豆激酶廣闊的藥用前景亟待開發成藥物用于治療血栓等疾病，在國外，也尚未見有國家正式批準納豆激酶作為藥品治療、生產的文件；在我國，以納豆激酶為主體的溶栓藥物尚未見于藥物應用，僅有納豆激酶制劑—恩開膠囊2000年進入中試階段。

高效液相色譜法分離效率高、選擇性好、靈敏度高、應用范圍廣和分析速度快，不僅適于各種多元組分復雜混合物的分析，而且能從一些復雜的混合物中排除干擾物質，并分析其中微量成分，定量分析目標物含量，為食品和藥物成分的定性和定量提供了迅速可靠的途徑。本發明提出的納豆激酶高效液相色譜檢測方法不僅可以準確對其純度進行定量，為其開發成藥物提供可靠原材料，而且為分離純化過程的得率計算提供可靠依據，納豆激酶HPLC純度標準檢測方法的建立為客觀的表述納豆激酶的純度提供了可能。

發明內容

考慮到目前國內外沒有建立納豆激酶純度的相關檢測技術指標以及檢測標準，本發明對其進行深入研究，制定檢測方法相關標準，為納豆激酶開發成藥物提供技術支持。

本發明采用適合蛋白分析的Agilent?ZORBAX?300SB-C₁₈色譜柱或Waters?XBridge?BEH300?C₄色譜柱，乙腈和0.1％TFA作為流動相，采用梯度洗脫程序進行分析，面積歸一化法進行定量，建立能夠在短時間內檢測納豆激酶純度的HPLC方法。

高效液相色譜法對納豆激酶的純度進行測定，使用Waters2695液相色譜儀，配紫外檢測器。具體檢測條件為：

色譜柱：Agilent?ZORBAX?300SB-C₁₈色譜柱，75mm×2.1mm；

????????Waters?XBridge?BEH300?C₄色譜柱，3.5μm；

流動相：乙腈/0.1％三氟乙酸(TFA)溶液，梯度洗脫程序見下表；

流速：1.0mL/min；

柱溫：40℃；

進樣量：20μL。

流動相梯度表

采用面積歸一化法測定含量，采用高效液相色譜法測定純度，能對藥物成分的分析和定量提供迅速可靠的途徑。

具體實施方式

1)樣品制備

將經過發酵液的預處理、陰離子交換樹脂去雜、陽離子交換樹脂分離、大孔吸附樹脂層析分離及冷凍干燥后得到的納豆激酶樣品，加水溶解，用高效液相色譜法進行純度檢測。

對照品：納豆激酶原同質標準品(凍干品)，用超純水復溶至蛋白濃度約1mg/mL，0.22μm水系濾膜過濾。

供試品：純化干燥后的納豆激酶樣品(凍干品)，用超純水復溶至蛋白濃度約1mg/mL，0.22μm水系濾膜過濾。

2)檢測條件

固定相：Agilent?ZORBAX?300SB-C18色譜柱

流動相：流動相A(含0.1％TFA的水)，取約800mL的雙蒸水于1000mL容量瓶中，用1mL刻度吸管移取1mL?TFA于上述量瓶中，用雙蒸水定容至刻度，搖勻，0.22μm濾膜(水系)過濾，超聲1min，即得；流動相B(含0.1％TFA的乙腈)，取約800mL乙腈于1000mL容量瓶中，用1mL刻度吸管移取1mL?TFA于上述量瓶中，乙腈定容至刻度，搖勻，0.22μm濾膜(有機系)過濾，超聲1min，即得。

HPLC參數設置：柱溫40℃，樣品池溫度4℃，紫外檢測波長280nm，流速1.0mL/min，10min內以B相30-70％的含量進行梯度洗脫；對照品分別進樣10、15、20、25、30μL，供試品進樣20μL。

對照品溶液分別進樣10、15、20、25、30μL，以得到的色譜圖中納豆激酶峰面積為縱坐標、進樣體積對應的蛋白總量為橫坐標，繪制標準曲線，以此計算納豆激酶樣品的含量。