[發(fā)明專利]適用降血壓肽工程菌的培養(yǎng)基

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201010547004.3
• 申請日: 2010-11-17
• 公開（公告）號: CN102102117A
• 公開（公告）日: 2011-06-22
• 發(fā)明（設計）人: 馬海樂;李云亮;任曉鋒;黃六容;曲文娟
• 申請（專利權）人: 江蘇大學
• 主分類號: C12P21/00
• 分類號: C12P21/00;C12R1/19
• 代理公司: 南京經緯專利商標代理有限公司 32200
• 代理人: 樓高潮

技術領域

本發(fā)明涉及發(fā)酵工程領域，更具體涉及到制備一種適用于降血壓肽工程菌高效表達的麥胚培養(yǎng)基。

背景技術

????降血壓肽?(antihypertensive?peptide，AHP)是一類能夠降低人體血壓的活性生物多肽的總稱。它是血管緊張素轉化酶?(angiotensin-converting?enzyme，ACE)的抑制劑，可通過抑制人體血管緊張素Ⅱ的生成而達到降低血壓的目的（參見：殷曉峰．等人，中國藥理學通報，19:971-975(2003)。)。由于降血壓肽具有低毒副作用、降血壓效果明顯、來源廣泛等特點，已成為目前研究的熱點。

現階段研究者主要致力于研究從各種天然蛋白質中獲取各種降血壓肽，分析獲得新結構的降血壓肽。由于從天然蛋白中提取降血壓肽步驟繁多，后期處理困難，而化學合成成本太高，這都限制了降血壓肽的研究和開發(fā)。近年來基因工程技術的發(fā)展為降血壓肽的開發(fā)利用帶來了機遇，但是有關技術還鮮有報導。

在江蘇大學食品與生物工程學院近幾年的研究中，利用工程菌(大腸桿菌BL21-MF3A3)發(fā)酵生產降血壓肽取得了成功，獲得了高活性的降血壓肽CEI-12和CEI-7混合肽。但是由于常規(guī)LB培養(yǎng)基（見表二）所用的進口牛肉膏蛋白胨成本太高，故為了擴大生產，降低成本，進行工業(yè)化生產，需要對發(fā)酵培養(yǎng)基的國產化進行研究。

降血壓肽一般含有較多的疏水性氨基酸，大腸桿菌BL21-MF3A3所要表達的降血壓肽CEI-12和CEI-7疏水性氨基酸含量也很高，其中苯丙氨酸占21%左右，因此培養(yǎng)基中各種氨基酸的組成對工程菌的表達有很大的影響。

小麥是我國主要糧食作物之一，年產量在1億噸以上。麥胚是小麥加工的廉價的副產品，長期以來沒有得到有效地開發(fā)和利用。麥胚含有豐富的大腸桿菌培養(yǎng)所需要的營養(yǎng)物質，其蛋白質含量達30%左右，并且麥胚蛋白質中含有較多疏水性氨基酸，其中苯丙氨酸等疏水性氨基酸的含量與牛肉相當(?參見：Grewe?E．等人，CerealChemistry，20：423-434?(1943)。)。因此研究利用麥胚蛋白水解物代替利用牛肉膏蛋白胨作為工程菌培養(yǎng)基中的氮源，對降低降血壓肽生產成本，提高降血壓肽表達效率以及有效的利用麥胚資源都有著重要的意義。

發(fā)明內容

本發(fā)明提供一種適用降血壓肽工程菌的麥胚培養(yǎng)基，以重量計其組成如下：葡萄糖0%-1%，麥胚蛋白酶解物1%-2%，酵母粉0%-1%，氯化鈉0.5%，其余為蒸餾水。

本發(fā)明中所述的麥胚蛋白酶解物按照下述方法制備得到：

1、脫脂麥胚加水，攪拌混勻，其中所述脫脂麥胚與水的質量體積比為18%-25%；

2、超聲處理時間為15-30min，超聲功率為400-800W/100mL，脈沖超聲處理的工作與間歇時間分別為2s和2s；

3、加入中溫淀粉酶，在40-50℃下酶解4-8h，其中所述中溫淀粉酶占脫脂麥胚總質量的2%-6%；

4、調pH至8.0，加入胰蛋白酶，在50℃下酶解2-3h，調pH至9.0，其中所述胰蛋白酶與脫脂麥胚的體積質量比為2%-6%；

5、加入堿性蛋白酶，45-55℃下酶解1-6h，其中所述堿性蛋白酶占脫脂麥胚總質量的1%-3%；調pH至6.5-7.5，100?℃滅酶10min，離心取上清液，噴霧干燥得麥胚蛋白酶解物。

本發(fā)明的優(yōu)點

本培養(yǎng)原料麥胚廉價易得，制備麥胚蛋白酶解物過程中極大保留和利用了麥胚的營養(yǎng)成分，工藝簡單方便，用此培養(yǎng)基培養(yǎng)大腸桿菌BL21-MF3A3的表達重組蛋白產率高于常規(guī)培養(yǎng)基。

具體實施方式

本發(fā)明使用的脫脂麥胚購自河南漫天雪面粉廠，中溫淀粉酶（活力4000u/mg）購自Novo公司，胰蛋白酶（活力2500u/mg）購自國藥集團，堿性蛋白酶為諾維信食品級堿性蛋白酶Alcalase2.4L購自諾維信公司，其他試劑為國藥分析純。

本發(fā)明所涉及的大腸桿菌BL21-MF3A3，已經另行申請專利，在“一種多活性肽的串聯(lián)DNA構建、表達及其應用”專利中有詳述，該菌種于2010年8月19日在中國武漢的中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏編號為Escherichai?coli?BL21-MF3A3?CCTCC?NO:?M?2010204。