[發明專利]表達高致病性禽流感病毒H5亞型血凝素蛋白的重組嗜酸乳桿菌

無效

• 申請號: 201010544665.0
• 申請日: 2010-11-16
• 公開（公告）號: CN101985630A
• 公開（公告）日: 2011-03-16
• 發明（設計）人: 楊倩;王志勝;庾慶華
• 申請（專利權）人: 南京農業大學
• 主分類號: C12N15/74
• 分類號: C12N15/74;C12N15/44;C12N15/66;C12N1/21;C12R1/23
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一、技術領域

本發明涉及表達高致病性禽流感病毒H5亞型血凝素蛋白的重組嗜酸乳桿菌，屬于生物技術基因工程領域。具體講涉及高致病性禽流感病毒H5亞型血凝素表達性質粒pLEM415-PHA1的構建、重組嗜酸乳桿菌4356菌株的獲得以及高致病性禽流感病毒H5亞型血凝素蛋白的表達與鑒定。

二、背景技術

幾個世紀以來，乳酸桿菌作為重要的益生菌已廣泛地應用于食品及飲料加工業，以乳酸桿菌作為發酵菌的食品工業所創造出的經濟價值占全球總的發酵類食品的20％。數千年，乳酸桿菌被人類大量食用，沒有引起任何的健康問題；同時乳酸桿菌可以作為抗原遞送載體誘導黏膜免疫應答和全身免疫應答，這引起了研究者們極大的興趣。這對于開發新型口服疫苗，提供了廣闊的空間。

1乳酸桿菌對黏膜免疫的影響

乳酸桿菌是人體和動物腸道中一種正常的益生菌，具有多種生理功能，如控制腸道感染、增加某些食物的營養價值、控制血清膽固醇水平、改善乳糖代謝、誘導體內特異性及非特異性免疫應答以及抗腫瘤活性等功能，在科學界越來越顯示出強大的生命力。作為一種重要的益生菌，多年來乳酸桿菌被大量用于食品的制造業，如干酪、酸乳酪和干臘腸。數千年來人們大量的消費這些食品，從未引起任何的健康問題。作為口服疫苗，乳酸桿菌還具有很好的安全性。因此，乳酸桿菌非常適宜作為安全的口服疫苗和其他病原體的抗原遞送載體。

進入胃腸道中的乳酸桿菌具備抗膽汁酸和在胃腸道中持續存在的能力，與一般微生物抗原一樣。乳酸桿菌在誘導黏膜免疫應答時或是經過小腸上皮之間的微皺褶細胞(microfold?cell，M細胞)，或者通過上皮下的樹突狀細胞(dendritic?cell，DC)進入固有層，激活Th2淋巴細胞，產生大量的白介素(IL)-5。后者是有效的IgA刺激因子，可激活B細胞，分泌IgA，IgA與腸黏膜上皮產生的分泌片段結合，形成黏膜表面抗體sIgA(分泌型IgA)，阻止致病菌的吸附和入侵。許多乳酸桿菌由于抗酸、抗膽汁鹽特性，能夠順利通過胃和回腸，大量存在于小腸和大腸的上游處。乳酸桿菌進入胃腸道后可持續誘導局部細胞免疫和體液免疫，并具有減少變態反應、增強腸道屏障功能和治療自身免疫病等功能。

乳酸桿菌能顯著增加腸道中非特異性和特異性抗體水平。對0-6個月健康新生兒的研究發現，腸道內的乳酸桿菌和雙歧桿菌定植的時間越早，外周血中IgA細胞出現得就越早；隨著腸內乳酸桿菌和雙歧桿菌數目的增加，外周血中的IgA細胞的數量也增加；輪狀病毒導致的腹瀉嬰兒中，喂食乳酸桿菌株后可使病程減短，病情減輕；減毒的Salmonellatyphi感染小鼠后，如果口服含有L.acidophilus發酵乳，小鼠體內針對S.typhi的血清總IgA水平均升高。乳酸桿菌還可明顯促進小腸中細胞免疫反應，如乳酸桿菌能增強腸上皮淋巴細胞細胞毒活性，誘導產生多種淋巴因子；激發固有層CD4⁺細胞產生干擾素；增強單核-吞噬細胞的吞噬作用，從而殺滅腸道病毒和腸道內的其他細菌。小鼠口服含有大量乳酸桿菌的Kefir奶后，可以協助特異性抗原提高小腸特異性黏膜免疫反應。乳酸桿菌中含有大量未甲基化的CpG?DNA，脂磷壁酸(1ipoteichoic?acids，LTA)和肽聚糖。通常些物質可與Toll樣受體(Toll?1ike?receptors，TLRs)結合，刺激先天免疫系統產生應激反應。所以口服乳酸桿菌對增強小腸特異和非特異性免疫應答均具有重要作用。

2口服黏膜免疫研究進展

口服黏膜免疫方法簡便、安全，不僅在黏膜局部和其他黏膜組織產生免疫應答，還可引起全身性體液免疫應答，多年來受到國內外免疫學家的密切關注。目前兒童廣泛口服的脊髓灰質炎糖丸就是一個消化道黏膜免疫成功的例子。脊髓灰質炎口服疫苗的應用，使全球小兒麻痹發病得到有效控制，為口服疫苗的研制與應用起到了指導作用。但是在實踐中，口服疫苗經過消化道時常受到消化液的降解，疫苗很容易被破壞，影響免疫力的效果，使消化道黏膜免疫方法的應用和推廣受到限制。近年來疫苗遞送系統成為研究傳染病防御領域新技術的熱點之一。尤其是細菌活載體疫苗因具有培養方便，外源基因容量大，刺激細胞免疫力強等優點具有巨大的應用潛力。細菌載體疫苗是新興現代疫苗的重要發展方向，所謂細菌載體疫苗是將所需的編碼病原菌特異性抗原的DNA片段插入減毒的病原菌或者共生菌中，讓其表達所編碼的抗原，以期達到預防一種或多種疾病的目的。通過活菌載體遞送疫苗抗原不僅可刺激腸道局部免疫應答，又可針對特異性抗原產生特異性免疫應答，使機體可以獲得全面的保護力。