[發明專利]一種靶向GOLPH3基因干擾小分子RNA及其抗膠質瘤遷移的用途

無效

• 申請號: 201010531309.5
• 申請日: 2010-11-04
• 公開（公告）號: CN102465125A
• 公開（公告）日: 2012-05-23
• 發明（設計）人: 葉思靈;陳國澤;殷姍;夏清梅;潘謳東
• 申請（專利權）人: 上海生博醫學生物技術有限公司
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/10;A61K48/00;A61P35/04
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技術領域

本發明涉及一種靶向GOLPH3基因干擾小分子RNA、其制備方法及應用。?

背景技術

RNA干擾(RNA?interference，RNAi)是指由雙鏈RNA介導的細胞內與其序列同源的mRNA發生特異性降解，從而導致基因表達沉默的現象，這是一種轉錄后水平的基因沉默機制。?

?本發明的目的之一在于提供一種靶向GOLPH3基因干擾小分子RNA。?

本發明的目的之二在于提供該干擾小分子RNA的制備方法。?

本發明的目的之三在于提供該干擾小分子RNA的應用。?

為達到上述目的，本發明采用如下技術方案：?

一種用于抗膠質瘤遷移的干擾小分子RNA，其特征在于該基因為SEQ?NO.1所示的堿基序列。

一種制備上述的用于抗膠質瘤遷移的干擾小分子RNA的方法，其特征在于該方法的具體步驟為：根據MAGic載體設計的具體要求，設計對應于GOLPH3基因757-775位，即:?GGT?GAG?ACA?TGG?AAT?CCA?T的shRNA的寡核苷酸序列，各為57bp，送華大基因研究中心進行合成；所述的shRNA的寡核苷酸序列為：?

SEQ?NO.1:

Sense:?5’-CCG?GGG?TGA?GAC?ATG?GAA?TCC?ATC?TCG?AGA?TGG?ATT?CCA?TGT?CTC?ACC?TTT?TTT?g?-3’

Anti-sense:5’-AAT?TCA?AAA?AAG?GTG?AGA?CAT?GGA?ATC?CAT?CTC?GAG??ATG?GAT?TCC?ATG?TCT?CAC?C?-3’；

根據MAGic載體設計的具體要求，將設計的shRNA的寡核苷酸序列引物和MAGic質粒進行連接，得到用于抗膠質瘤遷移的干擾小分子RNA。

一種上述的用于抗膠質瘤遷移的干擾小分子RNA在制備抗膠質瘤遷移的分泌藥物中的應用。?

本發明設計對抗膠質瘤遷移有關聯的基因的RNAi，并應用膠質瘤細胞模型研究其對抗膠質瘤增殖并促其凋亡的促進作用，為RNAi在膠質瘤的治療應用提供了一種新方法。?

?附圖說明

圖1為shRNA的寡核苷酸序列引物和P^MAGic質粒的連接圖。

圖2（A）為正常U251細胞的遷移。

圖2（B）轉染過GOLPH3-RNAi細胞的遷移。

???????具體實施方式：?

一、膠質瘤細胞的培養：膠質瘤細胞U251細胞系培養于37℃，5%CO₂恒溫培養箱。對數生長期的細胞用胰酶消化脫壁，之后加入適量培養液并反復吹打以混勻細胞；將得到的細胞懸液移入15ml離心管中，1500rpm離心3min；去上清；用5ml無菌1×PBS將細胞懸起，吹打混勻；加約1ml細胞懸液于裝有5ml新鮮培養基的新培養瓶中，放入37℃，5%CO_2?培養箱中培養，約2天左右傳代1次（主要查看細胞有無鋪滿培養瓶）。

二、人腦膠質瘤細胞的分離：取人腦膠質瘤手術標本,?浸入4℃的KRBB溶液中.?清洗二次,然后將標本剪成小塊,?轉移至盛有5mL?消化酶液的三角瓶中,?于恒溫搖床中37?℃保溫,?搖床轉速100r/min,?每10min玻璃管反復吹打一次,放置30min。將該懸液離心500-1000rpm，5min,?最后剩下為膠質瘤細胞.?用細胞培養液懸起沉淀，在黑背景的顯微鏡下觀察可發現到呈圓形的膠質瘤細胞。?

三、GOLPH3-RNAi質粒的設計和轉染：根據RNAi載體設計的具體要求，設計對應于GOLPH3基因757-775位，即:?GGT?GAG?ACA?TGG?AAT?CCA?T的shRNA的寡核苷酸序列，各為57bp，送華大基因研究中心進行合成；所述的shRNA的寡核苷酸序列為：?

SMAD1-RNAi?對應的序列為：

SEQ?NO.1:

Sense:?5’-CCG?GGG?TGA?GAC?ATG?GAA?TCC?ATC?TCG?AGA?TGG?ATT?CCA?TGT?CTC?ACC?TTT?TTT?g?-3’

Anti-sense:5’-AAT?TCA?AAA?AAG?GTG?AGA?CAT?GGA?ATC?CAT?CTC?GAG??ATG?GAT?TCC?ATG?TCT?CAC?C?-3’；