[發(fā)明專利]一種靶向乙型肝炎病毒基因的siRNA分子及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201010522005.2
• 申請日: 2010-10-28
• 公開（公告）號: CN101979558A
• 公開（公告）日: 2011-02-23
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 李鐵軍;陸毅祥;孫云成;唐小軍;王晉康;朱遠源;付博峻;M·格拉漢姆
• 申請（專利權(quán)）人: 百奧邁科生物技術(shù)有限公司
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;A61K48/00;A61P1/16;A61P31/20
• 代理公司: 上海申匯專利代理有限公司 31001
• 代理人: 翁若瑩

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種靶向乙型肝炎病毒基因的siRNA分子及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

肝炎，即肝臟炎癥，有多種致病因素-如病毒、細菌、寄生蟲、化學(xué)毒物、藥物和毒物、酒精等，侵害肝臟，使得肝臟的細胞受到破壞，肝臟的功能受到損害，它可以引起身體的一系列不適癥狀，以及肝功能指標(biāo)的異常。肝炎多數(shù)情況下指是由甲型、乙型、丙型、丁型、戊型等肝炎病毒引起的病毒性肝炎。

乙型肝炎病毒(Hepatitis?B?virus，HBV)感染導(dǎo)致的乙型肝炎，是一種嚴重威脅全球人類健康的的傳染性疾病，也是最嚴重類型的病毒性肝炎，它可造成慢性肝病，患者死于肝硬化和肝癌的風(fēng)險極高。

HBV屬嗜肝DNA病毒科(Hepadnaviridae)，全基因組長約3.2kb，為部分雙鏈環(huán)狀DNA。其基因組共有四個開放閱讀框(Open?Reading?Frame，ORF)，編碼蛋白包括表面抗原(S基因)，核心抗原(C基因)，聚合酶蛋白(P基因)和X蛋白(C基因)。

據(jù)世界衛(wèi)生組織報道，全世界估計有20億人感染HBV，其中有3.5億以上的人為慢性乙肝感染者，估計每年有60萬人死于急性或慢性乙型肝炎。HBV可造成急性病患，癥狀可持續(xù)數(shù)周，包括皮膚和眼睛發(fā)黃(黃疸)，尿色深，極度疲勞，惡心，嘔吐和腹痛。患者可能需要數(shù)月乃至一年才能痊愈。乙型肝炎病毒也會造成慢性肝臟感染，以后可能發(fā)展成肝硬化或肝癌。

乙型肝炎病毒通過與受感染者的血液或其他體液(比如，精液和陰道分泌物)接觸而在人與人之間傳播，傳播途徑與人類免疫缺陷病毒(艾滋病毒)相同。乙型肝炎病毒的傳染性比艾滋病毒強50-100倍，乙型肝炎病毒在體外可存活至少7天以上。在此期間，如果病毒進入未感染者的身體，它依然可造成感染。病毒潛伏期平均達90天，但也可能為大約30至180天不等。乙型肝炎病毒在感染后30至60天即可發(fā)現(xiàn)，持續(xù)時間差別很大。

目前主要是通過嬰兒接種乙型肝炎疫苗來預(yù)防乙型肝炎的發(fā)生，但盡管如此，人群HBV流行率仍然很高。目前主要治療慢性乙型肝炎的方法僅局限于抑制患者體內(nèi)病毒基因的表達和復(fù)制。如口服核苷類抗病毒藥-拉米夫定，主要功能是抑制HBV的復(fù)制，但是停藥后復(fù)發(fā)率高，長期應(yīng)用則可導(dǎo)致病毒變異，在用藥6個月后發(fā)生由病毒聚合酶基因發(fā)生變異引起的耐藥性，使得臨床抗病毒治療面臨極大的挑戰(zhàn)。

近幾年來，隨著RNA干擾(RNAi)技術(shù)的迅猛發(fā)展，為疾病尤其是癌癥開辟了全新的治療途徑，為科研工作者提供了一個全新的基因治療方法。該技術(shù)通過用小干擾RNA(small?interfering?RNA，siRNA)干擾特定靶基因的表達，來達到治療疾病的目的，是基因治療的重要組成部分。RNA干擾(RNA?interference，RNAi)是由雙鏈RNA(double-stranded?RNA，dsRNA)引發(fā)的轉(zhuǎn)錄后基因沉默機制。其作用機制是：核糖核酸酶III家族的Dicer酶，與dsRNA結(jié)合，將其剪切成21-23nt及3’端突出的siRNA，隨后siRNA與RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物(RNA-induced?silencing?complex，RISC)結(jié)合，解旋成單鏈，活化的RISC受已成單鏈的siRNA引導(dǎo)，序列特異性地結(jié)合到靶信使RNA(mRNA)上并將其切斷，引發(fā)靶mRNA的特異性分解，從而阻斷相應(yīng)基因表達。RNAi已作為一種簡單有效的基因敲除的技術(shù)，廣泛地應(yīng)用于功能基因組學(xué)研究以及抗病毒、抗腫瘤治療的研究中。

本發(fā)明提供了一種用RNAi技術(shù)來抗HBV的方法。應(yīng)用RNA干擾技術(shù)，用靶向至HBV基因的siRNA作為靶向藥物，在基因的轉(zhuǎn)錄后進行干擾，從而有效抑制HBV的蛋白表達和病毒復(fù)制，具有特異性強、高效、副作用小、可持續(xù)用藥的優(yōu)勢，且能彌補目前治療乙型肝炎藥物的不足，在不久的將來可能成為一種新的治療乙型肝炎的方法。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種通過siRNA全位點分子庫技術(shù)篩選出的高效靶向HBV基因的雙鏈siRNA分子，其下述正義鏈和反義鏈組成：

正義鏈：5’-CCAAACCUUCGGACGGAAAUUGCNN-3’(SEQ?ID?NO：3)

反義鏈：5’-GCAAUUUCCGUCCGAAGGUUUGGNN-3’(SEQ?ID?NO：4)

其中，N是A、T、C、G或U堿基的任何一種。

換言之，該雙鏈siRNA分子的主干序列為：

正義鏈：5’-CCAAACCUUCGGACGGAAAUUGC-3’(SEQ?ID?NO：5)