[發明專利]轉基因高油酸油菜W-4事件外源插入左邊界旁側序列及應用

無效

• 申請號: 201010513697.4
• 申請日: 2010-10-20
• 公開（公告）號: CN101967478A
• 公開（公告）日: 2011-02-09
• 發明（設計）人: 陳松;戚存扣;張潔夫;浦惠明;高建芹;胡茂龍;龍衛華;陳新軍;付三雄;陳鋒;顧彗;周曉嬰
• 申請（專利權）人: 江蘇省農業科學院
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12Q1/68
• 代理公司: 南京經緯專利商標代理有限公司 32200
• 代理人: 張素卿

技術領域：

本發明涉及農業生物技術領域中甘藍型轉基因高油酸油菜的檢測，具體地說，涉及一種甘藍型轉基因高油酸油菜W-4外源基因整合事件的外源插入載體(pCNFIRnos)左邊界旁側序列及應用。

背景技術

油酸是一種18碳單不飽和脂肪酸，是植物油脂的重要組成部分。油酸能降低低密度脂蛋白膽固醇(LDL)水平，維持高密度脂蛋白膽固醇(HDL)含量；油酸比亞油酸和亞麻酸等多不飽和脂肪酸穩定，耐高溫不易被氧化；高油酸菜籽油不僅有益于人們的身體健康，而且耐儲藏。發展高油酸油菜是目前油菜品質育種的一個重要組成部分。

通過基因工程途徑抑制油菜種子中油酸脫飽和酶基因(fad2)表達是提高油酸含量的重要策略。這在國內外均有成功的報道。

江蘇省農業科學院經濟作物研究所成功構建甘藍型油菜fad2基因的ihpRNA表達載體(pCNFIRnos)，并通過農桿菌介導法轉入甘藍型油菜，獲得油酸含量高達84％以上的甘藍型轉基因高油酸油菜品系W-4。

近年來，轉基因玉米、大豆、棉花、油菜、水稻等作物已經在很多國家獲準種植和商品化，一些轉基因農作物被加工成食用油、食品或飼料。鑒于轉基因農作物的生態安全或食用安全一直倍受爭議，30多個國家和地區相繼實施了轉基因產品標識制度。

轉基因產品的檢測主要依據轉基因產品中外源基因的序列信息、外源基因在植物表達載體上的組合方式，以及外源基因在受體基因組中的整合位點，而建立起來的方法。不同的方法各有利弊。

1.基因特異性檢測方法

一個特定的基因具有特定的序列特征，即特異性，以此特征建立的檢測方法對于檢測特定基因的存在與否是十分有效的，但是，問題是大量的轉基因載體使用了相同的基因，因此，基因特異性檢測無法區別不同來源的轉了相同基因的轉基因產品。

2.載體特異性檢測方法

不同的植物表達載體其T-DNA內部基因元件之間的組成或排列具有一定的特征。可以依據這些特征鑒別使用了類似基因元件的不同植物表達載體。但是同一個表達載體可能獲得一個以上的轉化植株，甚至可能被轉化到不同的物種中，而這些轉化株未必全部通過了轉基因的安全評估。因此，載體特異性檢測方法不能識別不同的轉基因品系。因此也無法判別該轉基因產品是否通過了轉基因安全評估。

3.事件特異性的檢測方法

鑒于獨立的轉基因事件中，外源基因在受體基因組中的整合位點具有隨機性，即使相同的載體多次轉化，整合的位置也是不可重復的，因此，外源基因的整合位點具有高度的特異性。可以利用整合位點的序列特征，開發出轉基因事件特異性的檢測方法。應用于轉基因產品的定性定量分析。

分離外源基因插入位點的旁側序列是建立事件特異性檢測方法的基礎。由于外源基因在整合過程中，T-DNA和基因組之間可能發生重組，導致T-DNA邊界的部分缺失。增加了分離插入位點旁側序列的難度。2000年2月，歐盟特別資助了Qpcrgmofood?European?Project項目，該項目已經成功分離得到多個品種旁側序列并應用于建立轉基因事件的特異性檢測。國內中國農業科學院油料作物研究所盧長明研究員實驗室也相繼獲得了多種轉基因油菜的旁側序列，并建立了相應的事件特異性檢測方法。

經對現有專利和其他文獻的檢索，尚未發現關于甘藍型轉基因油菜W-4事件外源基因插入載體(pCNFIRnos)左邊界旁側序列和利用此序列建立的事件特異性PCR檢測的報道。

發明內容

技術問題本發明目的提供一種甘藍型轉基因高油酸油菜W-4事件外源插入載體旁側序列及其應用。

技術方案

本發明是這樣實現的：

本發明以甘藍型轉基因高油酸油菜品系W-4為材料，利用TAIL-PCR技術擴增獲得W-4事件外源插入載體左邊界旁側序列SEQ?ID?NO.1。由來源于油菜基因組序列1至365個堿基和來源于外源插入載體序列525個堿基共同組成。

甘藍型轉基因高油酸油菜W-4事件外源插入載體左邊界旁側序列SEQ?ID?NO.1，序列總長度890堿基，其特征是：

第1至365個堿基來源于油菜基因組序列；

第366至890個堿基來源于外源插入載體序列。

上述甘藍型轉基因高油酸油菜W-4事件外源插入載體邊界旁側序列的應用：

(1)利用該序列特征設計的甘藍型轉基因高油酸油菜外源基因整合事件W-4的事件特異性定性PCR檢測方法；

(2)利用該序列特征設計的甘藍型轉基因高油酸油菜外源基因整合事件W-4的事件特異性定量PCR檢測方法；