[發明專利]一種制備偽狂犬病病毒的方法

有效

• 申請號: 201010513449.X
• 申請日: 2010-10-15
• 公開（公告）號: CN101979518A
• 公開（公告）日: 2011-02-23
• 發明（設計）人: 張許科;孫進忠;喬榮岑
• 申請（專利權）人: 洛陽普萊柯生物工程有限公司
• 主分類號: C12N7/00
• 分類號: C12N7/00;C12N7/02
• 代理公司: 北京華夏正合知識產權代理事務所(普通合伙) 11017
• 代理人: 韓登營

技術領域

本發明涉及一種偽狂犬病病毒的生產方法，更具體地說，本發明涉及一種利用哺乳動物細胞在潮汐式生物反應器的載體罐中大規模生產偽狂犬病病毒的方法。

背景技術

偽狂犬病(Pseudorabies，PR)是多種動物共患的傳染病，引起家畜和野生動物急性致死性的傳染病，以發熱、奇癢和腦脊髓炎為主要癥狀，豬是其自然易感宿主，主要引起妊娠母豬流產、死胎和木乃伊胎，仔豬感染主要是神經癥狀，成年豬則以隱性感染為主，該病已成為種豬繁殖障礙綜合癥的主要病因。疫苗免疫是防制偽狂犬病的根本措施，現在用得較多的是滅活苗、弱毒疫苗和基因缺失苗。弱毒苗和滅活苗在預防控制偽狂犬病方面雖然能起一定的作用，但弱毒活疫苗有返強和散毒的危險，滅活疫苗雖然安全性較好，但其免疫效率卻較低，劑量大，有副作用，而且不能提供血清學標志進行鑒別診斷。基因缺失疫苗免疫原性強、持久穩定，安全性好無致癌性、接種方便安全，還能提供血清學標志的鑒別標志。遺憾的是目前三種疫苗的生產主要依靠轉瓶生產，甚至仍在利用雞胚成纖維原代細胞進行生產。

傳統的轉瓶培養模式具有結構簡單，投資少，技術成熟，放大只需簡單的增加轉瓶數量等優點。但也有其缺點：(1)作坊式生產，勞動強度大，占地空間大，單位體積提供細胞生長的表面積小；(2)細胞生長密度低，產量低；(3)收獲病毒液后，后續混合，存在批間差，均一性不好；(4)培養時各項監測和控制環境條件受到限制等。另外，因雞胚原材料的差異導致雞胚成纖維原代細胞批間差異較大，造成偽狂犬病毒滴度不高，批間差異大，給疫苗的產量和效力的提高帶來困難。因此，本領域中仍迫切需要能夠進一步改善生產病毒疫苗的方法。

豬偽狂犬病毒具有廣泛嗜性，除了能在雞胚成纖維原代細胞增殖，還能在多種組織細胞上增殖。但對不同的細胞具有不同的敏感性。中國專利CN101695572A公開了利用豬睪丸細胞系ST、豬腎細胞系PK15或豬腎IBRS-2大規模生產偽狂犬活疫苗的方法。該發明提到了三種傳代細胞用來培養偽狂犬病毒：豬睪丸細胞系ST、豬腎細胞系PK15和IBRS-2，其中PK15細胞極易受豬圓環病毒I型的持續污染，目前國內難以找到未受污染的細胞株，顯然這存在著很大的安全隱患，特別是用來生產活疫苗，所以，至今國內未有利用PK15細胞培養病毒進而生產活疫苗的行政許可。偽狂犬病毒在ST細胞上增殖要比PK15慢(郝鵬等.PK15、ST細胞增殖偽狂犬弱毒效果的比較.首屆中國獸藥大會-獸醫生物制品學、獸醫微生物學學術論壇論文集(2008).339-340)，目前也有大量使用IBRS細胞進行偽狂犬病毒培養的報道，病毒增殖后的滴度也未降低，但IBRS細胞分裂增殖慢(見網址：http://biology.dctt.net/showarticle.asp？articleid＝26989)，幾乎比Vero細胞慢一倍，這大大提高了生產成本，降低了生產效率。Vero細胞經過全面的研究鑒定，Vero細胞具有遺傳學穩定，沒有外源因子污染和無致瘤性的優點，完全符合世界衛生組織(WHO)關于用于生物制品的傳代細胞的規程要求，已被WHO批準可用做疫苗生產基質。本發明采用Vero細胞可以解決目前生產偽狂犬病毒使用的上述傳代細胞存在的問題。

另外BHK-21細胞和MDBK細胞也可用來繁殖偽狂犬病毒，目前有利用Vero、BHK-21、MDBK細胞增殖偽狂犬病毒的報道(王巖等，PK15、Vero、BHK、CEF細胞增殖豬偽狂犬病病毒的比較，安徽農業科學，2007，35(18)：5432，5445；王樹成等，用PK15、Vero、MDBK三種細胞增殖偽狂犬病病毒的比較，畜牧與獸醫，1996，28(2)：80)，這些報道僅是關于實驗室階段利用細胞瓶進行偽狂犬病毒增殖的相關研究，不能直接放大，更不能達到工業化生產的要求。國內外有利用Vero細胞生產乙腦病毒疫苗和狂犬疫苗的專利和報道。至今未見把Vero細胞、MDBK細胞、BHK-21細胞等傳代細胞利用生物反應器進行進行偽狂犬病毒大規模生產的報道。

中國專利CN101695572A公開了大規模生產偽狂犬活疫苗的方法，采用的是TideCell潮汐式生物反應器，Batch式培養。本發明也采用潮汐式生物反應器，但采用了更有生物安全保障的細胞，并采用Fed-Batch式培養，通過優化參數實現高滴度多次收獲病毒液，大大提高了病毒的產量，進而在制備疫苗的后工藝中，不但提高了疫苗產量，也可大量減少殘余細胞宿主蛋白、殘余細胞DNA、殘余牛血清等異源物質的含量，進一步提高了疫苗接種的安全性，也更能夠符合WHO《使用動物細胞生產生物制品規程》的要求和市場需求。