[發明專利]一種保護霞水母毒素生物活性的方法

無效

• 申請號: 201010508895.1
• 申請日: 2010-10-10
• 公開（公告）號: CN102002094A
• 公開（公告）日: 2011-04-06
• 發明（設計）人: 李鵬程;李榮鋒;于華華;馮金華;邢榮娥;劉松;秦玉坤;李克成;孟祥濤;崔金會
• 申請（專利權）人: 中國科學院海洋研究所
• 主分類號: C07K1/00
• 分類號: C07K1/00;C07K1/14;C07K14/435
• 代理公司: 沈陽科苑專利商標代理有限公司 21002
• 代理人: 許宗富;周秀梅

技術領域

本發明涉及海洋生物技術領域，具體是一種保護霞水母毒素生物活性的方法。

背景技術

霞水母屬刺胞動物門，缽水母綱，旗口水母目，霞水母科，觸須4m-6m，廣泛分布于我國沿海，尤其夏季會在近海區域集中出現，給漁業生產、生態環境以及游泳者都造成了嚴重的影響，霞水母觸手上刺絲囊細胞的毒素能引起被蜇傷者皮疹、瘙癢、水腫、肌肉疼痛、血壓降低、呼吸困難甚至死亡。霞水母毒素是一類結構新穎的海洋生物蛋白，具有多種生物活性，如溶血活性、抗氧化活性、心臟血管毒性、肝臟毒性、酶活性和神經毒性等，為開發新型的海洋藥物提供重要的先導化合物，而如何有效地得到高生物活性的水母毒素是研究其毒素結構、理化性質、生物活性以及對水母毒素進行開發應用的前提。

以霞水母毒素的溶血活性為活性指標，溶血活性作為一個非常重要的生物活性。它是指能夠導致紅細胞破裂并伴隨著釋放出血紅蛋白的現象，而具有溶血活性的物質統稱為溶血素。溶血素主要存在于蜂毒、蛇毒、蜈蚣毒素、水母毒素等動物分泌的毒素中，同時也存在在于一些細菌產物中如Escherichia?coli的α-hemolysin、Bacillus?cereus的hemolysin?BL(HBL)和Bordetella?pertussis的FHAhemolysin等。溶血素主要是一些蛋白類物質，如銅綠假單胞菌(Pseudomonas?aerugi.nosa)的磷脂酶C和美人魚發光桿菌(Photobacteri.Um?damselae)的磷脂酶D，這些磷脂酶通過酶解細胞膜表面的磷脂分子層而造成細胞破裂出現溶血現象；另外還有由一些細菌產生的，能夠通過在紅細胞膜上形成小孔而產生溶血作用的溶血素。因此以溶血活性為活性指示，研究有對霞水母毒素生物活性的保護作用具有重要意義。

在提取霞水母毒素的過程中，很多細胞內的蛋白酶也被釋放出來，而蛋白酶的催化作用具有極高的效率，能夠迅速的造成活性蛋白的降解而使其活性降低甚至喪失。目前保護霞水母毒素生物活性的方法主要集中在向毒素中添加甘油、蔗糖、谷胱甘肽等物質來穩定毒素蛋白，雖然能起到一定的作用，但并不能從根本上解決活性蛋白被蛋白酶迅速降解導致的活性降低這一根本問題。

發明內容

本發明的目的在于提供一種保護霞水母毒素生物活性的方法。

為實現上述目的，本發明采用的技術方案為：

一種保護霞水母毒素生物活性的方法：在霞水母毒素內添加金屬酶抑制劑或酸性蛋白酶抑制劑，進而有效保護霞水母毒素生物活性。

所述在0.5-5mg/ml的霞水母毒素內添加終濃度0.1-20mM的金屬酶抑制劑EDTA和終濃度2-6μg/mL的酸性蛋白酶抑制劑Pepstantin?A，進而抑制毒素中蛋白酶的溶血活性。

所述霞水母毒素按如下步驟進行提取：

1)將冷凍于-80--20℃下的霞水母觸角于0-8℃自溶2-96h，而后以0-8℃下5000-30000g離心5-30min，收集沉淀霞水母刺絲囊細胞，待用；

2)將上述每5-50mg的霞水母刺絲囊細胞內加入0.5-2mL在0-8℃預冷的10-30mM?pH6.0-8.0緩沖液，然后在振動頻率2500-5000rpm下破碎1-5min，其中每破碎10-30s將霞水母刺絲囊細胞取出置于冰水中冷卻1-5min；

3)將破碎后霞水母刺絲囊細胞在0-8℃下，5000-30000g離心5-30min，上清液即為霞水母刺絲囊細胞毒素。

所述步驟1)中自溶后用20-60目的標準分樣篩濾去除觸手殘片。

所述步驟2)中霞水母刺絲囊破碎時利用Mini-Beadbeater組織研磨器破碎；所述緩沖液為0-8℃預冷的10-30mM?pH6.0-7.0的PBS緩沖液或0-8℃預冷的10-30mM?pH7.0-8.0的Tris-HCl緩沖液。

本發明所具有的優點：

1、資源非常豐富。本發明利用了霞水母這種豐富的海洋生物資源，為霞水母這種低值資源獲得高值化發展提供了新的途徑。

2、提取速度快。本發明能夠快速的從霞水母體內獲取大量的毒素，為其進一步應用提供了必要條件。

3、操作簡單方便。本發明僅是通過向提取的毒素內加入蛋白酶抑制劑，即可使其生物活性得到很好的保持，操作簡單方便。

4、提取的霞水母毒素生物活性高。本發明能夠快速有效地抑制毒素中蛋白酶活性，使具有生物活性的蛋白得到有效保護，從而獲取具有高生物活性的霞水母毒素蛋白。為霞水母活性物質的分離純化、結構鑒定、機理研究以及開發利用提供有力的保障。

附圖說明