[發明專利]一種高效液相色譜－熒光法同時測定血清色氨酸和酪氨酸的方法

無效

• 申請號: 201010300444.9
• 申請日: 2010-01-19
• 公開（公告）號: CN101750459A
• 公開（公告）日: 2010-06-23
• 發明（設計）人: 唐愛國;任亞萍;項忠元;周前選
• 申請（專利權）人: 中南大學湘雅二醫院
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N21/64
• 代理公司: 長沙市融智專利事務所 43114
• 代理人: 顏勇

技術領域

本發明屬于分析化學領域，涉及一種高效液相色譜-熒光法同時測定血清色氨酸和酪氨酸的方法。

背景技術

目前國內外報道的檢測Tyr和Trp的方法較多，包括高效液相色譜法(HPLC)、高效毛細管電泳法(HPCE)、質譜法(MS)等。HPCE分析時間較短，分離能力較強，但檢測限(紫外吸收檢測器)不及HPLC，且重復性較差；質譜技術亦有操作復雜、重復性較差的不足之處；相對來說，HPLC應用較廣泛。色氨酸(Trp)和酪氨酸(Tyr)具有吲哚結構，自身能產生熒光，故可采用熒光法檢測。國內外已有采用HPLC-熒光法(HPLC-FD)或HPLC-紫外法(HPLC-UV)分別單獨檢測血清中Tyr和Trp的報道，有采用HPLC-UV同時測定Tyr和Trp的報道，也有采用高效液相色譜法測定腦脊液中Tyr和Trp含量的報道，但目前尚未有采用HPLC-FD同時測定血清中的Tyr和Trp的報道。近來，Sanchez-Machado等用HPLC-FD同時測定蝦廢料中的Tyr和Trp含量，但是線性范圍窄，雖能滿足蝦廢料中氨基酸的檢測需要，但不能滿足臨床血清樣本的檢測要求。

發明內容

本發明的目的是提供一種高效液相色譜-熒光法同時測定血清色氨酸和酪氨酸的方法，本發明分析時間短，試劑消耗少，靈敏度高，特異性好，能滿足臨床血清樣本的檢測要求。

本發明可以通過以下技術方案實現。

本發明采用的檢測儀器是：510色譜泵、2475型熒光檢測器(Waters公司)、HS2000色譜數據工作站(杭州英譜科技開發有限公司)、Rheodyne?7725手動進樣器(帶20μL進樣環)。0.22μm濾膜及其抽濾器(Millipore公司)；Milli-Q純水器(Millipore公司)；TGLL?218臺式高速冷凍離心機(湖南湘儀離心機廠)；SB2200型超聲去氣儀(上海必信能有限公司)。

本發明的主要試劑有：Tyr、Trp、5-羥色胺(5-HT)、犬尿喹啉酸(Kyna)、苯丙氨酸(Phe)、犬尿氨酸(Kyn)和肌酐(Cr)均購自Sigma公司；乙腈、甲醇均為色譜純，購自美國Tedia公司；醋酸鋅、冰醋酸等均為國產分析純，高氯酸為國產優級純。

本發明采用的檢測條件是：其中色譜柱：Megres?C18柱(250mm×4.6mm?i.d.，5μm，江蘇漢邦科技有限公司)；流動相：10％(v/v)乙腈；流速：1.2mL/min；熒光檢測波長：0-5min激發光波長228nm，發射光波長為306nm；5min后激發光波長285nm，發射光波長為353nm；進樣量：20μl；室溫下測定。

本發明的檢測原理：色氨酸和酪氨酸可以產生自然熒光，利用熒光檢測器可調波長的性質選擇色氨酸和酪酸的最佳檢測波長，在最佳色譜條件下使色氨酸和酪氨酸分離，色譜分離后的兩種氨基酸經過熒光檢測器和色譜數據工作站的檢測和處理，作出色譜圖，然后根據色譜圖完成氨基酸的含量分析和測定。

本發明包括以下步驟：

a、采用Megres?C18柱250mm×4.6mm?i.d.，5μm色譜柱；

b、流動相的組成：10％(v/v)乙腈；

c、流速為1.2ml/min，進樣量：20μl，室溫下測定；

d、利用熒光檢測器掃描確定色氨酸和酪氨酸的最大激發光波長和發射光波長，進而使得兩種物質均在其最佳波長下得到檢測。可調波長設定為：0-5min激發光波長228nm，發射光波長為306nm；5min后激發光波長285nm，發射光波長為353nm；

e、對建立方法進行方法學評價：混合標準品和血清樣品的檢測、標準曲線和檢測限、精密度的評價、回收率的考察和干擾試驗。

與現有技術相比，本發明具有的優點和效果如下：

1、本發明首次成功建立了一種HPLC-FD同時測定人血清中Tyr和Trp的方法。Tyr和Trp具有自然熒光，本發明利用熒光檢測器自動轉換激發光與發射光波長的優勢，選擇Trp和Tyr的最佳波長，使Trp和Tyr的色譜峰峰面積最大，檢測靈敏度增加；與已報道方法比較，本發明分析時間短，試劑消耗少，靈敏度高，特異性好，能滿足臨床血清樣本的檢測要求。

2、本發明原理簡單、操作簡便、快速(9min可完成檢測)、可行性高。