[發明專利]一種利用微量基因組DNA進行全基因組甲基化位點精確檢測的方法

有效

• 申請號: 201010299315.2
• 申請日: 2010-09-21
• 公開（公告）號: CN102409408A
• 公開（公告）日: 2012-04-11
• 發明（設計）人: 孫繼華;閆淑靜;王君文;羅慧娟
• 申請（專利權）人: 深圳華大基因科技有限公司;深圳華大基因研究院
• 主分類號: C40B50/06
• 分類號: C40B50/06;C40B40/08;C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 中國國際貿易促進委員會專利商標事務所 11038
• 代理人: 羅菊華

1.構建全基因組甲基化高通量測序文庫的方法，所述方法用于微量基因組DNA，優選的是納克級別的基因組，更優選的是30-100ng的基因組，所述方法包括如下步驟：

步驟A目的基因組DNA及外源基因組DNA的片段化

目的基因組DNA和作為外源基因組DNA的材料可以為任意物種，其中包括各種植物、動物、微生物，例如人，植物特別是擬南芥，昆蟲，特別是哺乳動物包括人、小鼠的基因組DNA；進行片段化的方法包括霧化、超聲片段化、HydroShear或酶切處理，從而將基因組DNA打斷為大小優選地為100-200bp的片段；片段化方法中優選地采用超聲片段化法，外源基因組DNA優選地選擇擬南芥基因組DNA；

步驟B基因組DNA的末端修飾

對于經片段化的DNA，首先利用聚合酶包括但不限于Klenow、T4聚合酶和T4多聚核苷酸激酶以及dNTP補平末端，以產生平端化的DNA；然后優選地利用Klenow?Frgment(3’-5’exo-)聚合酶及dATP在補平的序列的3’末端加上“A”堿基；

步驟C微量建庫接頭連接及重亞硫酸鹽處理將步驟B所得到的3’末端加上“A”堿基的DNA序列在連接酶包括但不限于T4連接酶的作用下與經甲基化修飾，優選地C位點甲基化修飾的微量建庫接頭進行連接，優選地在序列兩端都連接上微量建庫接頭；然后在兩端加了接頭的片段中加入100-500ng，優選的200ng步驟A中片段化了的擬南芥基因組DNA，然后一起用重亞硫酸鹽處理，優選地處理2小時，從而使非甲基化胞嘧啶轉換為尿嘧啶；

步驟D?PCR擴增及文庫切膠純化

以步驟C所得到的重亞硫酸鹽轉換后的DNA為模板，加入針對微量建庫接頭序列的PCR引物序列，進行PCR擴增；PCR擴增優選地使用熱啟動taq酶，所述熱啟動taq酶包括但不限于常規的r-taq或其它聚合酶，擴增產物使用優選地2％的瓊脂糖進行電泳并將目的條帶切下純化后，即為待測序的文庫。

2.權利要求1所述的方法，其中步驟C中使用的微量建庫接頭是表1中所示的Minim_adapter?1和Minim_adapter?2。

3.權利要求1所述的方法，其中步驟D中使用的PCR引物是表1中所示的Minim_PCR?primer?1.1和Minim_PCR?primer?2.1。

4.通過權利要求1-3中任一項所述的方法構建的測序文庫，優選地是微量DNA全基因組甲基化高通量測序文庫。

5.通過權利要求1-3中任一項所述的方法構建的測序文庫，優選地是微量DNA全基因組甲基化高通量測序文庫用于進行測序的用途，其中所述測序可通過第二代測序平臺進行。

6.用于微量測序文庫，特別是微量DNA全基因組甲基化高通量測序文庫的接頭，其是表1中所示的Minim_adapter?1和Minim_adapter2。

7.權利要求6所述的接頭用于構建微量測序文庫，特別是微量DNA全基因組甲基化高通量測序文庫的用途。

8.使用權利要求6所述的接頭構建的微量測序文庫，特別是微量DNA全基因組甲基化高通量測序文庫。

9.用于微量測序文庫，特別是微量DNA全基因組甲基化高通量測序文庫的PCR引物，其是表1中所示的Minim_PCR?primer?1.1和Minim_PCR?primer?2.1。

10.權利要求9所述的PCR引物用于構建微量測序文庫，特別是微量DNA全基因組甲基化高通量測序文庫的用途。

11.使用權利要求9所述的PCR引物構建的微量測序文庫，特別是微量DNA全基因組甲基化高通量測序文庫。