[發明專利]一種固定化環糊精葡萄糖苷轉移酶及其制備方法和應用

無效

• 申請號: 201010297075.2
• 申請日: 2010-09-30
• 公開（公告）號: CN101974508A
• 公開（公告）日: 2011-02-16
• 發明（設計）人: 陳堅;堵國成;李江華;劉龍;張子臣
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N11/10
• 分類號: C12N11/10;C12N11/04;C12P19/60
• 代理公司: 北京匯信合知識產權代理有限公司 11335
• 代理人: 王秀麗

技術領域

本發明屬于生物催化技術領域，具體涉及一種固定化環糊精葡萄糖苷轉移酶及其制備方法和應用

背景技術

L-抗壞血酸(簡稱VC)在體內發揮著重要的生理作用，但其還原性強，極不穩定，這使得它在應用上受到了很大的限制。VC的衍生物則大大提高了它的穩定性，而不影響它的生理功能。本專利就其衍生物之一2-O-葡萄糖基抗壞血酸在糖基轉移酶的作用下的生物合成。

2-O-葡萄糖基抗壞血酸有著比L-抗壞血酸更廣泛的應用價值，其生物轉化合成法是唯一的生產方法。1990年日本林原生物化學研究所與岡山大學藥學系共同發現2-O-葡萄糖基抗壞血酸(AA-2G)，并已確定大量合成這種維生素C衍生物的方法。目前的研究主要集在對AA-2G生理功能研究。對于產量的提高主要通過篩選能產糖基轉移酶和優化發酵過程中的參數等來提高轉化效率。Prousoontorm等人通過共價結合的方法將環糊精葡萄糖苷轉移酶結合在3-Aminopropyltriethoxysilane(APTS)上。(Production?of?2-O-a-glucopyranosyl?L-ascorbic?acid?from?ascorbic?acid?and?b-cyclodextrin?using?immobilized?cyclodextrin?glycosyltransferase，Incl?Phenom?Macrocycl?Chem(2007)57：39-46)。雖然上述方法得到了固定化環糊精葡萄糖苷轉移酶，但是固定化后對酶活的損失很大，不到游離酶的一半。目前開發的固定化環糊精葡萄糖苷轉移酶，主要存在如下不足：(1)熱穩定性和貯存穩定性較差，不適合AA-2G的生產；(2)固定化成本較高，不適合工業化生產。

發明內容

本發明的所要解決的一個技術問題是提供一種固定化環糊精葡萄糖苷轉移酶的制備的方法。

為解決上述技術問題，提供如下技術方案：

首先環糊精葡萄糖苷轉移酶的酶液中加入分子篩吸附，其次加入戊二醛使混合液交聯，再經海藻酸鈉和氯化鈣的包埋，得到固定化的環糊精葡萄糖苷轉移酶。

具體步驟如下：

向酶液中加入2-10mg/mL的分子篩，置于搖床在16℃，150rpm下充分吸附；添加10μL/mL?25％的戊二醛溶液，使環糊精葡萄糖苷轉移酶與分子篩交聯4h；加入20mg/mL海藻酸鈉，與溶液混勻，放入4℃冰箱過夜脫氣；用注射器逐滴滴入濃度為3％CaCl₂溶液硬化1h，收集膠囊用蒸餾水沖洗至無蛋白析出，將沖洗后的膠囊置甘油中4℃冰箱保存備用。

所述環糊精葡萄糖苷轉移酶來源于Paenibacillus?macerans?JFB05-01(CCTCC?NO：M208063)，通過Escherichia?coli?BL21(DE3)(pET-20b(+)/cgt)在胞外表達。(Calcium?Leads?to?Further?Increase?in?Glycine-Enhanced?Extracellular?Secretion?of?Recombinant?r-Cyclodextrin?Glycosyltransferase?in?Escherichia?coli，J.Agric.Food?Chem.2009，57，6231-623)

所述Escherichia?coli?BL21(DE3)(pET-20b(+)/cgt)培養條件：

(1)種子培養：將保藏的菌種接入裝有50ml?LB培養基的250ml三角瓶中，回旋式搖床轉速200r/min，培養溫度為37℃，培養8小時。

(2)發酵培養：將培養好的種子培養液按4％(v/v)的接種量，接種至裝有100mL?TB培養基的500mL三角瓶中進行發酵培養，開始培養溫度為30℃，搖床轉速200r/min，當菌體培養至OD₆₀₀為0.6時，添加IPTG至0.01mM，同時添加一定量的甘氨酸或CaCl₂，迅速轉至25℃搖床，繼續誘導90h。

上述各培養基中使用前添加100μg/mL氨芐青霉素。

所述酶液可以為去除菌體后的發酵液，或上述發酵液去除雜質得到的精制酶液，其中環糊精葡萄糖苷轉移酶的活力為160U/mL。

本發明所要解決的另一個問題是提供一種通過上述方法制備的固定化環糊精葡萄糖苷轉移酶。

所述固定化環糊精葡萄糖苷轉移酶的最適溫度45℃，最適pH為5.0，貯存兩個月后仍然保持71.1％活力(圖4)。