[發明專利]一種狂犬病病毒屬診斷與分型芯片及制備方法

無效

• 申請號: 201010296325.0
• 申請日: 2010-09-29
• 公開（公告）號: CN101921880A
• 公開（公告）日: 2010-12-22
• 發明（設計）人: 涂長春;席進
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍軍事醫學科學院軍事獸醫研究所
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68
• 代理公司: 吉林長春新紀元專利代理有限責任公司 22100
• 代理人: 陳宏偉

技術領域

本發明公開一種狂犬病病毒屬診斷與分型芯片及芯片制備方法，用于狂犬病病毒屬診斷與分型的基因芯片（或寡核苷酸微陣列），屬于生物技術領域。

背景技術

狂犬病是一種所有溫血動物都易感的人獸共患病，狂犬病的病原屬于Lv。Lv屬彈狀病毒科（Rhabdoviridae）單分子負鏈RNA病毒目（Mononegavirales），具有高度的嗜神經性，常常引起人和動物的致命性腦脊髓炎。Lv主要包括7種基因型，分別為：基因1型經典狂犬病病毒Rabies?Virus（RABV）；基因2型的Lagos?bat?virus（LBV）；基因3型的Mokola?virus（MOKV）；基因4型的Duvenhage?virus（DUVV）；基因5型的European?bat?lyssavirus?1（EBLV-1）；基因6型的European?bat?lyssavirus?2（EBLV-2）；基因7型的Australian?bat?lyssavirus（ABLV）。目前我國人和動物的狂犬病野外分離株均屬于基因1型，尚無基因2~7型病毒自然感染病例的報道。

有效地檢測病原是狂犬病流行病學調查的基礎，由于同屬的病毒常引起相同的臨床癥狀，常規的免疫診斷和PCR檢測難以同時完成Lv的診斷與分型。目前常用基因分型檢測的方法整個過程繁瑣，費用高，獲得結果時間長。因此建立一種Lv快速有效的診斷與分型方法顯得十分重要。基因芯片技術是一種大規模集成的固相雜交技術，其基本原理是核酸分子雜交，即依據?DNA雙鏈堿基互補配對、變性和復性的原理，以大量已知序列的寡核苷酸、cDNA或基因片段作為探針，檢測樣品中與其互補的核酸序列，通過特定的檢測系統對雜交信號進行檢測，并配以計算機系統對每一雜交信號數據定性、定量分析和處理，迅速得出待測品的基因序列及表達的信息。與傳統基因診斷技術相比，基因芯片技術具有明顯的優勢，具備微型化、高通量、高度平行性和快速性的顯著特點。目前基因芯片技術已被廣泛應用于發現與疾病相關的新基因、基因表達分析、藥物研究與開發和對生物樣品中各種已知或未知病毒性病原體進行篩查、鑒定與分型的研究等。因此利用基因芯片技術對Lv診斷分型可彌補現有診斷方法的不足。

根據檢索，2009年英國VLA實驗室R.Gurrala等人利用隨機PCR標記樣品的方法結合基因芯片技術，建立了對Lv的芯片診斷與分型的方法。但是隨機PCR擴增本身存在偏性以及非特異性擴增，即大量擴增某一區域的基因或不依賴模板的非特異性擴增，使得擴增產物中病毒核酸的含量低，導致基因芯片的靈敏度降低，還易造成非特異性雜交。而本發明利用了特異性擴增Lv的7個基因型的通用引物（本發明人申請的，專利號ZL?2007?1?0056129.4），針對每個基因型設計了并篩選了特異性的探針，不但提高了芯片的整體檢測靈敏性，而且增加了芯片的特異性。

雖然目前的研究報道顯示，我國Lv的野外分離株均屬于基因1型，但是針對我國不同時期、不同省份狂犬病流行毒株的生態學、分子流行病學和遺傳多樣性的研究數據尚不充分，無法排除其他基因型的Lv的存在；同時考慮到大陸架構的特點，Lv易感物種分布的多樣性，以及我國加入WTO后對外貿易和人口流動增多的實際情況，建立一種快速、靈敏、特異性強的，可以同時對Lv的多種基因型診斷和分型的技術成為我國狂犬病防治工作的主要內容之一。

發明內容

本發明公開一種狂犬病病毒屬診斷與分型芯片及芯片制備方法，用于狂犬病病毒屬診斷與分型的基因芯片（或寡核苷酸微陣列），克服了現有的Lv診斷和分型方法靈敏度低，技術繁瑣，成本高和試驗周期長的缺點。

本發明公開的狂犬病病毒屬診斷與分型芯片，其特征如下：

醛基修飾的玻璃基片，點樣區、探針矩陣、標簽區，固定到玻片上的寡核苷酸探針組成，寡核苷酸探針5’端經氨基化修飾（見圖1）；

本發明公開狂犬病病毒屬診斷與分型芯片的制備方法如下：

（1）光學級醛基修飾的玻璃基片和點樣液；

（2）設計與合成Lv基因型特異探針

設計探針：根據GenBank數據庫中登錄的Lv各基因型全基因序列和N基因序列，利用生物信息學軟設計寡核苷酸探針。陽性對照探針為與目的基因同源型低的pGM-T載體序列設計，陰性對照探針根據擬南芥的基因組設計。所有寡核苷酸探針5’端氨基化修飾，人工合成。

（3）芯片點制設計及點樣后處理