[發明專利]胰島素B鏈HLA-A*0201限制性CTL表位改造肽配體及其獲得方法和應用

無效

• 申請號: 201010292304.1
• 申請日: 2010-09-26
• 公開（公告）號: CN101974071A
• 公開（公告）日: 2011-02-16
• 發明（設計）人: 王莉;舒馳;王書峰;陳曉玲;吳玉章
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍第三軍醫大學
• 主分類號: C07K7/06
• 分類號: C07K7/06;C07K1/00;A61K39/00;A61P3/10
• 代理公司: 北京同恒源知識產權代理有限公司 11275
• 代理人: 趙榮之

技術領域

本發明涉及一種改造肽配體(altered?peptide?ligand，APL)，特別涉及胰島素B鏈HLA-A*0201限制性CTL(細胞毒性T淋巴細胞)表位mInsB_5-14的APL，還涉及該APL的獲得方法和應用。?

背景技術

I型糖尿病(Type?I?diabetes)是由淋巴細胞介導的以胰島β細胞特異性損傷導致胰島素生成絕對不足為特征的一種自身免疫性疾病。I型糖尿病多發生在兒童和青少年，起病急，如不及時治療可引發累及心、肝、腎、神經、眼等重要組織器官的嚴重并發癥，是兒童和青少年致殘及早亡的主要原因之一。近年來，我國兒童和青少年患I型糖尿病的人數逐年遞增，I型糖尿病正在成為危害我國兒童和青少年健康的主要疾病。目前，I型糖尿病以胰島素終身替代療法和非特異性免疫抑制為主要治療手段，治療費用高昂且副作用大，因此，急需建立一種特異性免疫干預治療策略。?

大量動物實驗證實，給非肥胖性糖尿病(NOD)小鼠口服或接種自身抗原，可以減緩甚至完全阻斷I型糖尿病的發生、發展。既往研究發現，不管是糖尿病患者還是NOD小鼠，自身反應性Th1細胞在I型糖尿病的致病機制中占中心地位，因此，近年來發展了用自身反應性CD4⁺T細胞表位替代完整自身抗原來誘導免疫耐受的策略。相對于結構復雜的大分子天然抗原，小分子表位肽具有更易誘導免疫耐受、相對安全、易于實現規模化制備和純化等優點，最為重要的是可以通過一些氨基酸位點的化學修飾最大限度地增強其免疫調節的能力。例如，源于胰島素B鏈的mInsB_9-23是優勢性自身反應性CD4⁺T細胞表位，Alleva等采用丙氨酸突變掃描技術篩選出一條將mInsB_9-23的第16位和第19位氨基酸?同時替換為丙氨酸的APL，該APL免疫NOD小鼠后可以有效誘導Th1→Th2型應答轉換，從而阻斷I型糖尿病的發生。源于熱休克蛋白60的Hsp60_437-460也是一個優勢性自身反應性CD4⁺細胞表位，Raz等將其第6位和第11位的氨基酸同時替換為纈氨酸后獲得了一條穩定性更強的APL，該APL可以有效誘導Th1→Th2型應答轉換，在一定程度上減輕或者阻斷β細胞的免疫損傷，但臨床研究顯示其對I型糖尿病的防治效果卻因人而異，可能是由于免疫應答類型轉換在尺度上很難把握，一旦Th2輔助的體液免疫過分加強后，疾病最終轉歸則變得難以預料，這使得以調節CD4⁺T細胞應答為目的的免疫干預策略陷于尷尬境地。?

近年來在NOD小鼠模型研究中有愈來愈多的證據表明自身反應性CD8⁺T細胞(即CTL)在I型糖尿病中同樣具有十分重要的致病作用，其識別β細胞上的自身抗原CTL表位與MHC-I類分子形成的復合物，通過Fas/FasL、釋放穿孔素等途徑直接殺傷β細胞。已有研究利用自身抗原CTL表位或其APL在NOD小鼠體內成功誘導了特異性CTL免疫耐受，對I型糖尿病有一定的防治作用。?

同時研究報道，I型糖尿病的發生與人類HLA-A*0201分子密切相關。據統計，約60％的I型糖尿病患者攜帶HLA-A*0201等位基因。在HLA-A*0201轉基因NOD小鼠[NOD.129P2(B6)-β_2m^tmlUncTg(HLA-A/H2-D/β2M)]中，I型糖尿病的發病時間較普通NOD小鼠提前且程度加重，是良好的人源化動物模型。近年來已陸續鑒定出一系列人和小鼠I型糖尿病自身抗原HLA-A*0201限制性CTL表位，其中部分存在較高的人、鼠交叉反應性。因此，利用人源化NOD小鼠篩選對自身反應性CTL具有負調節效應的APL，對于人類I型糖尿病的防治研究具有重要意義。?

在人源化NOD小鼠中，源于胰島素B鏈的mInsB_5-14(即鼠源胰島素B鏈第5到14位氨基酸)已被證實為HLA-A*0201限制的免疫優勢性CTL表位，且與人源表位具有高度的交叉反應性。因而，通過改造天然表位mInsB_5-14來獲得在HLA-A*0201背景下能顯著下調mInsB_5-14特異性CTL應答水平的APL，對于人?類I型糖尿病的防治研究具有重要的實際意義和良好的應用前景。?

發明內容