[發明專利]一種利用木瓜蛋白酶酶解豬皮膠原蛋白制備的抗凍多肽

無效

• 申請號: 201010292036.3
• 申請日: 2010-09-26
• 公開（公告）號: CN101921317A
• 公開（公告）日: 2010-12-22
• 發明（設計）人: 汪少蕓;洪晶;饒平凡
• 申請（專利權）人: 福州大學
• 主分類號: C07K7/08
• 分類號: C07K7/08;C07K1/20;C07K1/18;C07K1/16;C12P21/06
• 代理公司: 福州元創專利商標代理有限公司 35100
• 代理人: 蔡學俊

技術領域

本發明涉及一種抗凍多肽，更具體地涉及了一種利用木瓜蛋白酶酶解豬皮膠原蛋白制備的抗凍多肽，屬于生物技術領域。

背景技術

食品和醫藥產品在低溫儲存和運輸過程中由于環境溫度的波動變化而反復地遭受冰晶生長和重結晶的問題越來越受到人們的關注。溫度的反復升降使冰晶不斷生長、凍融和重結晶，嚴重破壞細胞和組織結構而失去產品應有的品質。世界范圍內的科學家正面臨嚴肅的挑戰：如何控制冰晶生長及重結晶，實現低溫冷鏈上的冰晶生長控制，是制約眾多食品和醫藥產品品質的關鍵所在。

抗凍蛋白（antifreeze?proteins,?AFPs）或者稱“冰結構蛋白”（ice?structuring?proteins），是一類附著在冰晶體（ice?crystals）表面而抑制冰晶的生長和重結晶的活性蛋白質。抗凍蛋白由于其具有控制冰晶生長、減少細胞損傷及保持產品原有組織結構、質地和品質的特點和突出意義而成為熱點研究主題，近年來國內外對抗凍蛋白的研究十分活躍,《Nature》和《Science》密切跟蹤報道抗凍蛋白方面的最新研究進展。目前的研究主要集中在從極地魚類、陸地昆蟲、植物和細菌等生物體中分離到多種抗凍蛋白，并尋求它們在食品、醫學和其它工業上的應用。伴隨著多種抗凍蛋白的發現和研究的深入，其制約生物體抗凍蛋白的研究和應用的二大關鍵問題也日益凸現：?1.天然分離純化所得到的數量微少，非常有限的數量限制了它在食品和醫學上的大規律應用前景；?2.當科學家致力于轉基因技術以擴大生物體來源的抗凍蛋白產量時，轉基因抗凍蛋白在食品應用中的安全性顧慮又成為廣大消費者、歐盟組織和國際FDA組織所共同擔憂的焦點問題。

同樣的研究還表明，抗凍蛋白的抗凍活性片斷只存在于局部的特異多肽鏈結構域而并不是整體蛋白質在起作用，即使是純化了的抗凍蛋白，抗凍活性往往不高，仍然需要探究其活性域來進一步提高抗凍效率。?所以,如何獲得食品源的結構緊湊的高活性抗凍多肽，就成為抗凍蛋白迫切的研究方向。

發明內容

為了解決上述問題，本發明提供了一種利用木瓜蛋白酶酶解豬皮膠原蛋白制備的抗凍多肽，使抗凍活性得以高效地實現。

本發明的一種抗凍多肽，氨基酸序列為Gly-Pro-Arg-Gly-Leu-Hyp-Gly-Glu-Arg-Gly-Arg-Hyp-Gly-Pro-Hyp-Gly。所述抗凍多肽由16個氨基酸殘基所構成。

所述抗凍多肽的制備方法如下：

以豬皮膠原蛋白為原料，采用木瓜蛋白酶對其進行酶解，分離純化、冷凍干燥得到抗凍多肽；酶解條件為：pH為7.0、溫度是37℃、酶解時間為30分鐘、酶-底物配比為1:10（w/w）；所述酶為木瓜蛋白酶；所述分離純化的具體步驟為：酶解產物首先利用Sephadex?G-50凝膠色譜進行分離，洗脫液為去離子水，流速為1mL/min，洗脫峰在225nm下進行測量；收集具有最佳抗凍活性的峰，利用RP-HPLC－C18反相高效液相色譜再進一步的分離，反相HPLC的分離以10%-90%?乙腈溶液梯度洗脫，流速為1mL/min，收集最具活性的峰，得到高純度的特異性抗凍多肽。

為了實現上述方案，本發明采取的具體步驟如下：

(1)????膠原蛋白酶解條件的優化

本發明所采用的酶和豬皮膠原蛋白購自Sigma生物試劑公司（中國·上海）。

采用單因素實驗，分別對三個酶解因素進行考察，分別為酶解溫度（37℃，45℃和55℃）、酶解時間（10，20，30，40和60分鐘）以及酶-底物配比（1:100,1:50,1:20,1:15和1:10?w/w）。稱取1.65克豬皮膠原蛋白溶解于6ml半胱氨酸濃度為10mM/L的?Mili-Q水中，然后用2mol/L?NaOH將其pH調節至7.0。先將該溶液水浴加熱到需要溫度，接著再按不同的酶-底物配比加入相應量的酶，按照預定的反應時間開始反應。接著再在沸水浴中滅酶10分鐘，冷卻后再10000rpm離心10分鐘。上清液收集后，分別對其抗凍活性進行測定，以確定最佳酶解條件。得到具有最大抗凍活性的酶解液的酶解條件是：pH為7.0、溫度是37℃、酶解時間為30分鐘、酶-底物配比為1:10。

(2)????酶解產物的分離、純化