[發明專利]胸腺肽注射液的制備方法

有效

• 申請號: 201010291725.2
• 申請日: 2010-09-26
• 公開（公告）號: CN101934068A
• 公開（公告）日: 2011-01-05
• 發明（設計）人: 呂家燕
• 申請（專利權）人: 武漢華龍生物制藥有限公司
• 主分類號: A61K38/22
• 分類號: A61K38/22;A61K9/08;C07K14/575;C07K1/36;C07K1/34;C07K1/30;A61P37/02;A61P37/04;A61P35/00
• 代理公司: 武漢開元知識產權代理有限公司 42104
• 代理人: 俞鴻

技術領域

本發明屬于生物制藥領域，具體涉及一種胸腺肽注射液的制備方法。

背景技術

胸腺肽注射液，曾用名：胸腺素注射液、胸腺因子注射液、胸腺因子D注射液，系由健康豬或小牛胸腺組織中提取的分子量小于10000道爾頓的多肽水溶液。本品具有調節和增強人體免疫功能的作用，能促使T-淋巴細胞成熟。用于治療各種原發性或繼發性T細胞缺陷病、某些自身免疫性疾病、各種細胞免疫功能低下的疾病及腫瘤的輔助治療。

目前，已公開了一些有關胸腺肽的制備工藝，是經凍融破細胞、離心分離、超濾、濃縮等過程。通常包括以下方法：(1)用絞肉機或勻漿器將新鮮的的胸腺勻漿，凍融，以破碎細胞；(2)用水在酸性或中性環境中提取破碎細胞；(3)將提取液加熱到80℃左右維持10分鐘，離心除蛋白沉淀；(4)離心液經10000分子量左右的超濾膜超濾得胸腺肽：(5)根據胸腺肽含量加注射用水配制各種濃度注射液制劑。

上述的工藝方法僅經過熱變性去除雜蛋白，不能充分有效的去除各類雜蛋白，雜蛋白未有效去除易引起過敏反應；其次熱變性時間短，不能有效去除各類動物源性病毒，使制劑存在病毒污染風險；再者注射液中氨基酸、小肽類物質易發生聚合為大分子物質而析出致使制劑不穩定，也易引起過敏反應。

發明內容

本發明的目的在于提供一種胸腺肽注射液的制備方法，以克服上述技術的缺陷。

本發明的胸腺肽注射液的制備方法的技術方案為：它是將小牛或豬的胸腺組織去除脂肪，洗凈后，與0.9克/毫升的氯化鈉水溶液按1∶1的重量比例混合后利用膠體磨研磨得到絞磨液，將絞磨液用體積濃度為20％的冰醋酸調節pH值3.5-4.5，在-15～-22℃溫度下冷凍冷；將冷凍后的絞磨液化凍升溫至33-37℃勻漿得勻漿液，然后加溫到80℃，保溫30分鐘，再離心分離得第一上清液；將第一上清液按1∶1的體積比加入無水乙醇，0-5℃靜置1?2小時以上，再離心分離得第二上清液；濃縮第二上清液至原勻漿液體積的1/4～1/6得濃縮液；濃縮液調節pH值7.5-8.5，然后加溫至80℃，保溫30分鐘，再降溫至10℃～0℃以下后，離心分離得第三上清液；第三上清液先后用50KD、10KD超濾膜逐級超濾澄清后再利用5KD至8KD的超濾膜超濾得胸腺肽溶液；在胸腺肽溶液中加入注射用水調節至每毫升溶液中含胸腺肽2.5mg或5mg或10mg；加入穩定劑，滅菌后即得胸腺肽注射液。

本發明先后通過50KD、10KD，5KD超濾膜多級超濾，既能保證雜蛋白的徹底去除，又能有效地去除高分子量物質；采用乙醇和酸堿沉淀去除雜蛋白，以及多級超濾，制得產品高分子物質少于0.5％，遠遠低于國家標準規定的少于5.0％，能更有效地保證產品質量，制劑配料過程中加入吐溫-80作穩定劑，能有效得避免制劑在儲存過程中氨基酸、小肽類物質等聚合為大分子物質析出，影響制劑的澄明度，保證產品長時間儲存過程的穩定，同時降低過敏反應發生率。

具體實施方式

取新鮮的小牛(或豬)胸腺組織，剝離其附著的脂肪，用飲用水和純化水先后分別清洗三次。

將小牛(或豬)胸腺組織與0.9克/毫升的氯化鈉水溶液即生理鹽水(溫度不高于30℃)按1∶1的重量比例混合后加入膠體磨反復絞磨兩次，收集絞磨液。

將絞磨液用用20％的冰醋酸調節pH值3.5-4.5，置于冷庫冷凍7天以上。

取出冷凍7天以上的絞磨液化凍后置反應罐在33-37℃勻漿4-5小時，然后加溫到80℃，保溫30分鐘，再離心(3000轉/分鐘，時間為30分鐘)，棄沉渣取上清。

在不斷攪拌下將上清液按1∶1的體積比加入無水乙醇，0-5℃靜置12小時以上，離心(3000轉/分鐘，時間為30分鐘)，棄沉渣取上清。

減壓真空濃縮(溫度：35-45℃真空度-0.03～-0.08MPa)至原勻漿液體積的1/5。濃縮的同時回收乙醇。

將上清液用10％氫氧化鈉溶液調節pH值7.5-8.5，然后將罐內溫度加溫至80℃，保溫30分鐘，用冰水降溫至10℃以下后，離心(3000轉/分鐘，時間為30分鐘)，棄沉渣取上清。

上清液用50KD、10KD超濾膜逐級超濾澄清后得澄清液。

澄清液再用5KD-8KD超濾膜超濾得胸腺肽溶液。

制劑：將胸腺肽按質量標準方法測定多肽含量，加注射用水調節至每毫升含胸腺肽2.5mg(或5mg、10mg)，同時加入穩定劑吐溫-80至每毫升含量為1-2‰，然后灌裝、滅菌后即得胸腺肽注射液。

產品檢測：對上述制備的產品的檢測結果如下表1

檢測結果表1：

病毒滅活效果檢測：

按本發明的制備工藝，在勻漿液中加入偽狂犬病毒(Pseudorabies?virus，PRV)為指示病毒，經過80℃×30分鐘的熱處理后，以IBRS-2細胞作為培養用細胞，采用96孔細胞病變法檢測病毒的滴度，以細胞病變(CPE)作為判別病毒存在的指標，對未出現細胞病變的樣品用細胞進行盲傳三代。通過病毒對照培養結果顯示，采用上述熱處理方法，可以使偽狂犬病毒滴度下降PRV7.4個LogTCID50/0.1ml，樣本經盲傳一代、二代、三代，均未見特異致細胞病變作用(CPE)。