[發明專利]小牛血去蛋白提取物的制備方法

有效

• 申請號: 201010291699.3
• 申請日: 2010-09-26
• 公開（公告）號: CN101947242A
• 公開（公告）日: 2011-01-19
• 發明（設計）人: 呂家燕
• 申請（專利權）人: 武漢華龍生物制藥有限公司
• 主分類號: A61K35/14
• 分類號: A61K35/14;A61P9/10;A61P25/00;A61P25/28
• 代理公司: 武漢開元知識產權代理有限公司 42104
• 代理人: 俞鴻

技術領域

本發明屬于生物制藥領域的血液制品，具體涉及一種小牛血去蛋白提取物的制備方法。

背景技術

小牛血去蛋白提取物注射液，曾用名：血活素注射液，系由新鮮小牛血或血清經去蛋白、濃縮、超濾或透析等工藝制得的含有無機物及小分子有機物的滅菌水溶液。本品可增強組織細胞對氧及葡萄糖攝取與利用，改善細胞乏氧狀態和機體內環境，增加心、腦、肝等臟器的血流量，改善微循環。用于腦缺血、腦癡呆、腦外傷及大腦功能不全等腦細胞代謝障礙性疾病的治療。

該注射液中的無機物包括鉀、鈉、鈣、鎂、銅、鐵、鋅等電解質和微量元素。這些無機離子能夠調節細胞膜的通透性，控制、維持正常滲透壓和酸堿平衡，幫助運輸各種元素到全身，參與神經活動和肌肉收縮等；微量元素可以與有關藥效成分協同配合，并通過配合、螯合反應而起到治療疾病的作用。有機物包括氨基酸、小肽、核苷酸、嘌呤等，可進入組胞參與蛋白質的合成，細胞代謝，使人體獲得正氮平衡，并生成酶類、激素、抗體、結構蛋白，促進組織愈合，恢復正常生理功能。

目前，已公開了一些有關小牛血去蛋白提取物的制備工藝，多數工藝采用乙醇沉淀、酶解等方法去除雜蛋白。也有用柱層析除雜的方法。

該注射液在臨床使用中發生不良反應主要是因為雜蛋白未有效去除，有機物類物質如氨基酸、小肽、核苷酸、嘌呤等發生聚合為大分子物質而引起過敏反應。

發明內容

本發明的目的在于提供一種能有效去除小牛血中雜蛋白的小牛血去蛋白提取物的制備方法，以解決現有技術的缺陷。

本發明的技術方案為：將小牛血進行低溫冷凍、升溫，再重復進行低溫冷凍、升溫后；再加入注射用水升溫至75～85℃，保溫25～40分鐘后；過濾棄渣，再離心分離后取第一上清液；將第一上清液冷卻至0-5℃，攪拌加入-10～-20℃的冷丙酮，在-20℃～5℃的低溫環境下靜置后，迅速離心，棄沉渣取第二上清液；減壓真空濃縮第二上清液，得濃縮液；調節濃縮液的pH值3.5-4.5，75～85℃℃保溫25～40分鐘，冷卻至室溫離心分離，棄沉渣取第三上清液；調節第三上清液pH值7.5-8.5，75～85℃保溫25～40分鐘，冷卻至室溫離心分離，棄沉渣取第四上清液；調節第四上清液pH值6.5-7.5后，然后再分別利用50KD、10KD和5KD超濾膜逐級超濾澄清后得澄清液，得小牛血去蛋白提取物。

所述將小牛血進行低溫冷凍、升溫，再重復進行低溫冷凍、升溫是：將小牛血在≤-15℃的溫度下存放不少于三天后；再將冷凍的小牛升溫到35±2℃融化；待全部融化為液態無硬心時，再次小牛血在≤-15℃的溫度下存放不少于三天后，再將冷凍的小牛升溫融化，如此反復三次。

所述濃縮液的體積是所述小牛血體積的1/4～1/6。

將得到的小牛血去蛋白提取物中加注射用水調節至每毫升溶液中含小牛血去蛋白提取物總固體物為40mg；加入穩定劑。

本發明將小牛血采用低溫反復凍融，能使細胞內外的有效物質充分釋放，保證有效成分的充分提取；提取工藝中采用80℃，30分鐘能使雜蛋白變性，同時能滅活病毒，再加上后續的超濾工藝，能充分保證牛源性病毒的滅活，保證制劑產品的安全性；本法采用丙酮和酸堿沉淀去除雜蛋白，較傳統僅用乙醇沉淀法能更有效去除各類雜蛋白；先后通過50KD、10KD，5KD超濾膜多級超濾，既能保證雜蛋白的徹底去除，又能有效地控制高分子量物質，本發明制備的小牛血去蛋白提取物中的高分子物質，經檢測少于0.3％，較“國家標準高分子物質不得過2.0％”的規定更為嚴格，能更好的保證產品質量，保證臨床安全性；制劑配料過程中加入吐溫-80作穩定劑，能有效得避免制劑在儲存過程中有機物類氨基酸、小肽、核苷酸、嘌呤等聚合為大分子物質析出，影響制劑的澄明度，保證產品長時間儲存過程的穩定，同時降低過敏反應發生率。

具體實施方式

從健康六月齡內的小牛取血后迅速置于低溫冷庫(≤-15℃)中存放三天以上。

從低溫冷庫(≤-15℃)取出小牛血在35±2℃的水浴池中融化。待全部融化為液態無硬心時，再次放入低溫冷庫(≤-15℃)冷凍三天以上后取出融化，如此反復三次。

在反應罐內加入融化的小牛全血和等體積的注射用水。夾層蒸汽將罐內溫度加溫至80℃，保溫30分鐘。

先用濾布過濾棄渣，再離心(14000rpm/min)后取上清液。

將上清液冷卻至0-5℃，在不斷攪拌下按小牛血體積1∶1的比例加入-10～-20℃預冷的冷丙酮，在不高于5℃的低溫環境下靜置2小時后，迅速離心，棄沉渣取上清液。