[發明專利]冷凍法提取棘皮動物變態前幼體DNA的方法

無效

• 申請號: 201010291347.8
• 申請日: 2010-09-26
• 公開（公告）號: CN102409038A
• 公開（公告）日: 2012-04-11
• 發明（設計）人: 常亞青;趙新亞;丁君
• 申請（專利權）人: 大連海洋大學
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C12Q1/68
• 代理公司: 大連非凡專利事務所 21220
• 代理人: 曲寶威

技術領域

本發明涉及一種提取DNA的方法，特別是一種冷凍法提取棘皮動物變態前幼體DNA的方法。

背景技術

海膽屬棘皮動物門海膽綱，是一類較常見的海洋無脊椎動物，也是生物科學史上最早被使用的模式生物，它的卵子和胚胎對早期發育生物學的發展具有舉足輕重的作用。海膽受精卵經早期胚胎發育、浮游幼體、匍匐變態三個主要發育階段發育至稚海膽。海參屬棘皮動物門海參綱，是一種經濟價值很高的水產動物，海參發育也經由浮游幼體發育到稚海參。海參、海膽幼體形態小，一般不超過1mm，另外，在變態過程中，其形態結構、棲息方式、攝食習性等發面發生很大變化，因此死亡率也明顯增加，因此提取幼體基因組DNA進行相關分析研究具有了一定意義。

水產動物的DNA提取主要見于成體，幼體DNA的提取較少，目前所見的海洋水產動物幼體DNA的提取方法為DMSO固定法，其方法為將幼體樣品保存在終濃度為20％的DMSO固定液中，實驗時再從固定液中取出幼體，用純水把固定液沖洗干凈，這一步驟較為麻煩，而且DMSO為強毒性物質，對實驗者傷害很大。

發明內容

本發明的目的是提供一種操作過程簡單、無毒副作用、對操作者無傷害的冷凍法提取棘皮動物變態前幼體DNA的方法，克服現有技術的不足。

本發明的冷凍法提取棘皮動物變態前幼體DNA的方法，步驟如下：

a、在解剖鏡下用微量移液器取棘皮動物幼體放入離心管中，并在-80℃條件下冷凍保存；

b、將裝有棘皮動物幼體的離心管取出解凍，并在解凍后10分鐘內向離心管中加入15ul裂解液，1ul的0.3mg/ml的蛋白酶K，然后放入55℃水浴鍋中裂解3小時，期間每隔半小時振蕩搖勻一次；所述裂解液的組分及終濃度為10mmol/LTris-Cl，50mmol/L?KCL，0.5％Tween-20，PH8.0；

c、裂解完后把水浴鍋溫度升至85℃，水浴15分鐘，以滅活蛋白酶K；裂解完的樣品直接用于PCR擴增，獲取擴增產物，微衛星擴增PCR體系組成如下：

反應體系??????需加體積

DNA模板???????1ul

10×buffer????2.5ul

引物??????????1.0ul/each

d?NTP?????????2.2ul

MgCl2?????????1.5ul

Taq???????????0.35ul

dd?H2O????????15.45ul

Total?????????25ul。

本發明的冷凍法提取棘皮動物變態前幼體DNA的方法與現有技術相比，操作簡單，容易控制，無毒副作用，對操作者沒有任何傷害。

具體實施方式

以海膽為例，步驟如下：

a、在解剖鏡下用微量移液器取1個海膽幼體放入0.2ml的離心管中，并在-80℃條件下冷凍保存；

b、將冷凍的裝有海膽幼體的離心管取出解凍，并在解凍后10分鐘內向離心管中加入15ul裂解液，1ul的0.3mg/ml的蛋白酶K，然后放入55℃水浴鍋中裂解3小時，期間每隔半小時振蕩搖勻一次；所述裂解液的組分及終濃度為10mmol/L?Tris-Cl，50mmol/L?KCL，0.5％Tween-20，PH8.0；

c、裂解完后把水浴鍋溫度升至85℃，水浴15分鐘，以滅活蛋白酶K；裂解完的樣品直接用于PCR擴增，獲取擴增產物，微衛星擴增PCR體系組成如下：

反應體系??????需加體積

DNA模板???????1ul

10×buffer????2.5ul

引物??????????1.0ul/each

d?NTP?????????2.2ul

MgCl2?????????1.5ul

Taq???????????0.35ul

dd?H2O????????15.45ul

Tota??????????25ul。

對于海參采用上述同樣的方法操作。

將擴增產物用1％瓊脂糖凝膠電泳法進行檢測，取5ul擴增產物混合3ul上樣緩沖液在瓊脂糖凝膠上點樣進行檢測，檢測結果顯示通過此方法獲得的DNA質量好，能用于進行各種分子生物學實驗分析。