[發(fā)明專利]一種鴨疫里默氏桿菌LAMP檢測試劑盒及其檢測方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201010290683.0
• 申請日: 2010-09-21
• 公開（公告）號: CN102409084A
• 公開（公告）日: 2012-04-11
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 于圣青;韓先干;丁鏟;胡青海;陳鴻軍;仇旭升;宋翠萍
• 申請（專利權(quán)）人: 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;G01N21/64
• 代理公司: 上海百一領(lǐng)御專利代理事務(wù)所(普通合伙) 31243
• 代理人: 馬育麟

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種鴨疫里默氏桿菌LAMP檢測試劑盒及其檢測方法。

背景技術(shù)

鴨疫里默氏菌(Riemerella?anatipestifer，RA)病是一種主要侵害鴨、火雞和其他鳥類的禽類接觸性傳染病，其血清型復(fù)雜，迄今為止，已公認的RA有21個血清型(1～21型)，各血清型之間缺乏交叉保護的能力。該病主要病理變化是纖維素性心包炎、肝周炎、氣囊炎、腦膜炎、干酪樣輸卵管炎等，發(fā)病率高，病死率高，耐過鴨多成僵鴨，生長遲緩，造成極大的經(jīng)濟損失，是目前危害禽類養(yǎng)殖業(yè)的主要傳染病之一。

鴨疫里默氏桿菌病多繼發(fā)其他疾病或與其他傳染性疾病并發(fā)，其臨床癥狀和病理解剖往往缺乏特征性，增加了疾病的診斷和防治難度，必須通過實驗室診斷進行確診。目前實驗室的診斷方法主要包括細菌學(xué)方法(如細菌的分離鑒定)、血清學(xué)方法(如酶聯(lián)免疫吸附試驗)和分子生物學(xué)(如聚合酶聯(lián)式反應(yīng))等方法，但上述方法所需檢測時間長、特異性和靈敏性低且必須配備專用設(shè)備，操作復(fù)雜，常有非特異性出現(xiàn)。

近年來，由NotomiT等開發(fā)的一種簡單、迅速、特異的核酸擴增方法環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)(Loop-mediated?isothermal?amplification，LAMP)，被廣泛的應(yīng)用于多種病毒性疾病和細菌性疾病的診斷中(Notomi，T.，Okayama，H.，Masubuchi，H.，et?al.Nucleic?Acids?Res.2000(28)，e63；K.Nagamine，T.Hase，T.Notomi.Molecular?andCellular?Probes.2002(16)：223-229)。該技術(shù)使用4條不同引物識別6個不同區(qū)域的靶基因，應(yīng)用鏈置換擴增反應(yīng)在恒溫條件下完成擴增；具有很高的擴增效率，在15到60min內(nèi)可將DNA擴大10⁹-10¹⁰倍；不需要特殊試劑和精密設(shè)備。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種快速、特異性和靈敏性高的鴨疫里默氏桿菌檢測試劑盒和檢測方法。

為此，本發(fā)明公開了一種鴨疫里默氏桿菌LAMP檢測試劑盒，其包含3對引物：F3和B3；FIP和BIP；LF和LB，其中所述F3的核酸序列如SEQ?ID?NO.1所示，所述B3的核酸序列如SEQ?ID?NO.2所示，所述FIP的核酸序列如SEQ?ID?NO.3所示，所述BIP的核酸序列如SEQ?ID?NO.4所示，所述LF的核酸序列如SEQ?IDNO.5所示，所述LB的核酸序列如SEQ?ID?NO.6所示。

在一些實施例中，所述鴨疫里默氏桿菌LAMP檢測試劑盒還含有熒光染料、10×反應(yīng)緩沖液、DNA聚合酶、dNTP(2.5mM?each)、甜菜堿(Betaine?solution，5M)。所述熒光染料為能與雙鏈DNA結(jié)合產(chǎn)生熒光的染料，可為溴化乙錠、SYBRGreen?I熒光染料或Hoechst?33258，最優(yōu)選為SYBR?Green?I熒光染料。

另一方面，本發(fā)明還公開了一種鴨疫里默氏桿菌的檢測方法，包括下列步驟：

a)取禽類的體液或組織液并以此為模板；

b)利用3對引物：F3和B3；FIP和BIP；LF和LB進行LAMP反應(yīng)，其中所述F3的核酸序列如SEQ?ID?NO.1所示，所述B3的核酸序列如SEQ?ID?NO.2所示，所述FIP的核酸序列如SEQ?ID?NO.3所示，所述BIP的核酸序列如SEQ?ID?NO.4所示，所述LF的核酸序列如SEQ?ID?NO.5所示，所述LB的核酸序列如SEQ?ID?NO.6所示，反應(yīng)條件為94℃5分鐘，0℃20秒，65℃?20-60分鐘，80℃滅活；

c)檢測LAMP反應(yīng)產(chǎn)物。

在一些實施例中，所述禽類為鴨、火雞、雞或鳥類中任何之一。

在一實施例中，步驟b中所述反應(yīng)條件為94℃5分鐘，0℃20秒，65℃20分鐘，80℃滅活；

在一些實施例中，步驟c中所述檢測LAMP反應(yīng)產(chǎn)物的方法為瓊脂糖凝膠電泳法、熒光顯色法或分光光度計法。所述熒光顯色法為SYBR?Green?I熒光顯色法。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下的優(yōu)點：

1)6條引物對序列的8個特異區(qū)域進行識別，擴增反應(yīng)只有在6條引物完全識別靶序列的情況下才能進行，在很大程度上減少了擴增反應(yīng)的背景，保證了LAMP擴增的高度特異性。

2)對硬件設(shè)備基本無要求，在普通的生物學(xué)實驗室就可完成檢測工作，減少了污染的機會并方便了實驗過程中的質(zhì)控工作。