[發明專利]一株產鼠李糖脂生物表面活性劑菌株及其生產的菌劑

有效

• 申請號: 201010271627.2
• 申請日: 2010-09-03
• 公開（公告）號: CN101948793A
• 公開（公告）日: 2011-01-19
• 發明（設計）人: 洪青;王倩;蔣建東;李榮;李順鵬
• 申請（專利權）人: 南京農業大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;B09C1/10;A62D3/02;C12R1/40;A62D101/20
• 代理公司: 南京經緯專利商標代理有限公司 32200
• 代理人: 張素卿

一、技術領域

本發明提供一種可產生鼠李糖脂生物表面活性劑的菌株及其生產的菌劑，屬于生物高技術領域。是利用微生物學方法，促進土壤中多環芳烴的降解，可以應用于多環芳烴污染土壤的生物修復。

二、背景技術

多環芳烴(Polycyclic?Aromatic?Hydrocarbons，PAHs)是一類廣泛存在于環境中的難降解有機污染物。近年來，隨著石油、煤、天然氣等資源開發利用的不斷加快，環境中的多環芳烴有不斷增加的趨勢。由于多環芳烴的潛在毒性、致癌性及致畸誘變作用，對人類健康和生態環境具有明顯的生態風險。芘是具有四個苯環的稠環芳烴，是檢測多環芳烴污染的指示物。生物修復技術被認為是最具潛力去除土壤或沉積物中有機污染物經濟有效的方法。但由于PAHs的水溶性差，憎水性強，易吸附于沉積物或土壤的固體顆粒上，生物有效性差，從而延緩了其生物降解的速率。添加表面活性劑可增強PAHs從固體顆粒釋放的速率，增大其在水中的溶解度，并通過減小固液相之間的界面張力來促進沉積物所吸附PAHs的流動，從而提高污染物的傳質速率和生物有效性。目前，生物表面活性劑中最重要，數量最大，品種最多的是糖脂類生物表面活性劑。而在糖脂中最常見，研究最深入，應用最廣泛的就是鼠李糖脂。鼠李糖脂在促進多環芳烴污染物的修復處理中有著顯著效果。銅綠假單胞菌(Pseudomonas?aeruginosa)是研究的最多的鼠李糖脂產生菌。利用以銅綠假單胞菌為生產菌株雖然可以獲得較高的產量，但銅綠假單胞菌又名綠膿桿菌，是一種人體條件致病菌，會帶來一系列的安全問題，不能大規模工業化應用，這就迫使人們要尋找其它非致病菌作為生產鼠李糖脂的主體。這方面的研究主要集中在利用基因工程的方法，以實現鼠李糖脂的外源生產。目前為止，還是通過質粒為載體構建基因工程菌，這中方法存在質粒不穩定和引入抗生素標記的缺陷。迫切需要開發新的方法。

三、發明內容

技術問題本發明的目的在于針對環境修復中的實際問題和需求，開發研制出一種新型鼠李糖脂生物表面活性劑的菌株及其生產的菌劑。它是將銅綠假單胞菌(Pseudomonas?aeruginosa)BSFD5中和鼠李糖脂類生物表面活性劑合成相關的基因簇rhlABRI，通過無標記同源重組的方法，整合到惡臭假單胞菌(Pseudomonas?putida)的模式菌株KT2440的染色體中而獲得。Pseudomonas?putida?KT2440是一株在全世界范圍內得到詳盡研究和應用的菌株，是第一個被美國衛生部重組DNA委員會(Recombinant?DNA?Advisory?Committee，RAC)認定為環境安全細菌，并許可KT2440作為基因工程的宿主菌。本發明構建的菌株KT2440-rhlABRI和現有的已質粒為基礎的工程菌相比，該菌株穩定性好，生產過程中不需要添加抗生素，安全性高。菌株及其生產的菌劑可以促進土壤中多環芳烴芘的降解。

技術方案

本發明提供一種可產生鼠李糖脂生物表面活性劑的菌株KT2440-rhlABRI，它是將銅綠假單胞菌(Pseudomonas?aeruginosa)BSFD5中和鼠李糖脂類生物表面活性劑合成相關的基因簇rhlABRI，通過無標記同源重組的方法，整合到惡臭假單胞菌的模式菌株KT2440的染色體中而獲得。使用菌株KT2440-rhlABRI生產菌劑的工藝為：斜面種一搖瓶種一種子罐-生產罐-產品(包裝劑型為液體菌劑)。詳細步驟為：

1)將菌株KT2440-rhlABRI接種于LB培養基搖瓶中，振蕩培養至對數期。LB培養基配方為：酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl?10g/L，加水補足體積，pH值7.0-7.2。

2)將上述培養好的菌種按10％的接種量接種入500升種子罐，培養至對數生長期。種子罐所用的培養基配方為：NaNO₃?2.5g/L，K₂HPO₄?4.0g/L，KH₂PO₄?4.0g/L，CaCl₂·2H₂O?0.1g/L，MgSO₄?0.2g/L，NaCl?1.0g/L，KCl?1.0g/L，酵母粉1.0g/L，甘油30g/L，加水補足體積，pH值7.0-7.2。

3)將種子液按生產罐培養基的10％接種量接入生產罐培養，生產罐所用培養基與種子罐培養基相同。