[發(fā)明專利]調(diào)控胚胎干細胞及早期胚胎的胚層分化的方法和試劑

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201010268307.1
• 申請日: 2010-08-31
• 公開（公告）號: CN102382796A
• 公開（公告）日: 2012-03-21
• 發(fā)明（設計）人: 金穎;李翔;朱莉莉
• 申請（專利權）人: 中國科學院上海生命科學研究院
• 主分類號: C12N5/0735
• 分類號: C12N5/0735;C12N5/073;C12Q1/66;C12Q1/02
• 代理公司: 上海專利商標事務所有限公司 31100
• 代理人: 陳靜

技術領域

本發(fā)明屬于生物技術領域；更具體地，本發(fā)明涉及調(diào)控胚胎干細胞分化及早期胚胎的胚層分化的方法和試劑。

背景技術

胚胎干細胞(Embryonic?Stem?Cells，ES)是由著床前囊胚內(nèi)細胞團(Inner?Cell?Mass，ICM)的細胞在體外分離培養(yǎng)所建成的全能性細胞系。它具有自我更新和發(fā)育多能性的特點。一方面通過對稱分裂而快速增殖，產(chǎn)生未分化的子代群體；另一方面，能夠分化為包括體內(nèi)三胚層細胞以及生殖細胞在內(nèi)的多種類型的細胞。這兩大特性使ES細胞具有極其重要的基礎研究價值和巨大的臨床應用前景，可應用于早期胚胎發(fā)育過程的研究，藥物毒物篩選，細胞移植治療，基因治療等領域。目前的研究表明，外源性LIF-STAT3和BMP-SMAD通路對于ES細胞維持自我更新具有至關重要的作用。在沒有其他因子存在的無血清培養(yǎng)基中，僅僅添加LIF(leukemia?inhibitor?factor)和BMP4(bone?morphogenetic?protein?4)兩種因子便可成功的在體外培養(yǎng)ES細胞。在這種條件下生長的ES細胞具有典型的ES細胞的所有特性。在ES細胞的多能性維持方面，除了外源性信號性分子起關鍵作用外，以轉(zhuǎn)錄因子Oct4，Sox2，Nanog為核心的轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控網(wǎng)絡對于ES細胞維持自我更新也具有至關重要的作用。這些轉(zhuǎn)錄因子的表達僅存在于早期胚胎發(fā)育過程中的多能細胞中，如ICM、Epiblast等。隨著胚胎的進一步發(fā)育，這些多能細胞逐漸分化成成熟的組織細胞類型而喪失了多能性，而此時這些多能性相關的轉(zhuǎn)錄因子的表達也就隨之消失。然而調(diào)控ES細胞胚層分化的分子機制目前研究不是很清楚，研究僅表明激活ERK-1/2通路可以觸發(fā)ES細胞進行胚層分化，而抑制這條通路可以不依賴LIF部分維持ES細胞自我更新。但除了ERK-1/2通路以外，是否有其他信號通路參與調(diào)控ES細胞胚層分化目前并不清楚。

自我更新和分化多能性是胚胎干細胞的重要特性。但是，ES細胞從維持自我更新到胚層分化轉(zhuǎn)變的分子調(diào)控機制目前研究并不清楚。

綜上，本領域非常有必要研究其它相關的信號通路，以對ES細胞的發(fā)育和分化作出更深的了解。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供調(diào)控胚胎干細胞及早期胚胎的胚層分化的方法和試劑。

在本發(fā)明的第一方面，提供鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶(Calcinuerin)-活化T細胞核因子(NFAT)信號通路的調(diào)節(jié)劑的用途，用于制備調(diào)節(jié)胚胎干細胞(ES)分化和胚胎(特別是早期胚胎)發(fā)育的組合物。

在另一優(yōu)選例中，所述的調(diào)節(jié)劑是抑制劑，其用于制備抑制胚胎干細胞分化和胚胎發(fā)育的組合物。

在另一優(yōu)選例中，所述的抑制劑選自(但不限于)：環(huán)孢素A(cyclosporine?A，CsA)；FK506；VIVIT；GM6001；PP2；特異性干擾鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶基因表達的干擾分子(如siRNA)；特異性結合鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶的抗體或配體。

在另一優(yōu)選例中，所述的干擾分子是SEQ?ID?NO：1或SEQ?ID?NO：2所示序列的分子。

在另一優(yōu)選例中，所述的抑制胚胎干細胞分化和胚胎發(fā)育包括：抑制胚胎干細胞進行胚層分化；維持胚胎干細胞自我更新。

在另一優(yōu)選例中，所述的調(diào)節(jié)劑是促進劑，其用于制備促進胚胎干細胞分化和胚胎發(fā)育的組合物。

在另一優(yōu)選例中，所述的促進劑是一表達載體，其中含有鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶編碼基因或活化T細胞核因子編碼基因；或者，所述的促進劑是促進Ca²⁺信號通路的物質(zhì)。

在另一優(yōu)選例中，所述的促進胚胎干細胞分化和胚胎發(fā)育包括：促進胚胎干細胞進行胚層分化。

在另一優(yōu)選例中，所述的早期胚胎是指發(fā)育0-4.5天的胚胎。

在另一優(yōu)選例中，所述的鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶包括亞基：CnA(包括Ppp3ca、Ppp3cb、Ppp3cc)、CnB(包括Ppp3r1，Ppp3r2)；或

所述的活化T細胞核因子包括：NFATc1、NFATc2、NFATc3、NFATc4。

在另一優(yōu)選例中，所述的組合物還用于：與Erk1/2信號通路共同作用，激活下游靶基因Src或促進上皮-間充質(zhì)細胞轉(zhuǎn)換(EMT)。、

在另一優(yōu)選例中，所述的鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶-活化T細胞核因子信號通路與Erk1/2信號通路共同作用激活下游靶基因Src或促進上皮-間充質(zhì)細胞轉(zhuǎn)換。

在本發(fā)明的另一方面，提供一種篩選(體外篩選)調(diào)節(jié)胚胎干細胞分化和胚胎發(fā)育的潛在物質(zhì)的方法，所述的方法包括：