[發明專利]小麥黃矮病毒的多重PCR檢測方法

無效

• 申請號: 201010267645.3
• 申請日: 2010-08-31
• 公開（公告）號: CN101921876A
• 公開（公告）日: 2010-12-22
• 發明（設計）人: 吳云鋒;楊洋
• 申請（專利權）人: 西北農林科技大學
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68
• 代理公司: 北京億騰知識產權代理事務所 11309
• 代理人: 陳惠蓮

技術領域

本發明屬于植物病毒學技術領域，特別是涉及小麥黃矮病毒的多重PCR檢測方法。

背景技術

小麥是全世界最主要的糧食作物之一，我國的種植面積居世界首位。但是，病毒病及其它病害嚴重影響了小麥的產量和質量。大麥黃矮病毒病(Barleyyellow?dwarfvirus，BYDV)是一種全球性的病毒病害。每年對世界糧食生產造成一定程度的危害，大發生時會造成嚴重減產。在我國，該病主要流行于北方麥區，引起的小麥黃矮病是重要的流行病害。1987年僅陜西和甘肅兩省就因該病害的流行損失5億多公斤小麥，1998年大面積流行發生范圍遍及陜西、山西、寧夏、內蒙和河北等多個省(自治區)。為了保證小麥生產的產量和質量，準確鑒定小麥病害，了解其流行動態，以盡早做好防范措施。因此小麥生產上急需一種較為靈敏、準確和快速的病害檢測方法。

早期的檢測方：生物學、血清學、電鏡觀察、核酸雜交和PCR技術都先后用于檢測小麥病毒，但是一些傳統的檢測方法靈敏度不是很高，而且都只針對單一病毒的檢測，對多種病毒混合檢測時，需要耗費較多的時間和試劑。

多重PCR(M-PCR)是在普通PCR(polymerase?chain?reaction)的基礎上加以改進，于一個PCR反應體系中加入多對特異性引物，針對多個DNA模板或同一模板的不同區域擴增多個目的片段的PCR技術。與常規的單一PCR相比，多重PCR可以同時檢測多種病害，極大地提高檢測效率，降低檢測成本。目前國內有單重和熒光PCR檢測BYDV-PAV、GPV、GAV，而在田間經常表現為多種病害復合侵染；并且其癥狀極其相似，需要用分子方法進行區分。利用單一PCR對多種病毒進行系統檢測的工作量較大，因而多重RT-PCR在小麥病害的檢測中的優越性更為明顯。

發明內容

本研究針對我國小麥病害發生的現狀，利用設計的特異性引物對，摸索和優化多重PCR反應體系的條件參數等，建立了能從小麥葉片組織中同時檢測BYDV種群PAV、GPV、GAV三種病毒的復合侵染田間樣品的多重PCR檢測方法。

具體的，本發明提供了一種利用多重PCR反應同時檢測小麥黃矮病種群中PAV、GPV、GAV?三種病毒的方法，該方法包括小麥病毒總RNA的提取、逆轉錄反應制備cDNA模板，多重PCR反應，電泳檢測，確定病毒種類，其特征在于逆轉錄反應制備cDNA模板應用引物SEQ?ID?NO.2、SEQ?ID?NO.4和SEQ?IDNO.6，多重PCR反應中應用引物SEQ?ID?NO.1-6。

SEQ?ID?NO.1-6的核苷酸序列如下：

SEQ?ID?NO.1：5’-ATGAATTCAGTAGGCCGTAGG-3’(PAV?F)

SEQ?ID?NO.2：5’-CTATTTGGCCGTCATCAAGTG-3’(PAV?R)

SEQ?ID?NO.3：5’-GGTCGCCCTTAGAAATG-3’(GPV?F)

SEQ?ID?NO.4：5’-GCCTCGGTGATGAACTG-3’(CPV?R)

SEQ?ID?NO.5：5’-GTAGAAATAACCGCAGGAG-3’(GAV?F)

SEQ?ID?NO.6：5’-GACTTGAGTATTCCACCTGA-3’(GAV?R)

上述方法中，優選地，在多重PCR反應的反應體系中，緩沖液濃度為0.4×-0.9×；dNTPs濃度為0.1-0.5mM；Mg²⁺濃度為1.0-3.5mM；退火溫度為51-55℃；循環次數為20-45次；延伸時間為30-55s。

上述方法中，優選地，多重PCR反應的反應體系中，緩沖液濃度為0.4×、0.5×、0.6×、0.7×、0.8×或0.9×；dNTPs濃度為0.1mM、0.2mM、0.3mM、0.4mM或0.5mM；Mg²⁺濃度為1.0mM、1.5mM、2.0mM、2.5mM、3.0mM或3.5mM；退火溫度為51℃、52℃、53℃、54℃或55℃；循環次數為20、25、30、35、40或45次；延伸時間為30、35、40、45、50或55s。

上述方法中，更加優選地，多重PCR反應的反應體系中，緩沖液濃度為0.8×或0.9×，dNTPs濃度為0.4mM或0.5mM，Mg²⁺濃度為2.5mM或3.5mM，退火溫度54℃，延伸時間45s，循環次數30次。

上述方法中，尤其優選地，多重PCR反應的反應體系中，TaqDNA聚合酶濃度為0.04U/μL-0.06U/μL。