[發明專利]某種梭菌D-塔格糖3-差向異構酶的核苷酸序列及其應用

無效

• 申請號: 201010264400.5
• 申請日: 2010-08-27
• 公開（公告）號: CN102373230A
• 公開（公告）日: 2012-03-14
• 發明（設計）人: 孫媛霞;朱玥明
• 申請（專利權）人: 天津工業生物技術研究所
• 主分類號: C12N15/61
• 分類號: C12N15/61;C12N9/90;C12N15/63;C12N1/15;C12N1/19;C12N1/21;C12N5/10;C12P19/24
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

【技術領域】：本發明屬于生物技術領域和遺傳工程領域，涉及從一種梭菌(Clostridiumcellulolyticum)中克隆D-塔格糖3-差向異構酶(DTE)基因的核苷酸序列及其應用。將該基因與不同表達載體連接，轉入到細菌、酵母、植物或動物中，利用其編碼的DTE生產D-阿洛酮糖的方法和應用。

【背景技術】：近年來發現了一類低熱量、具有多生物學功能的單糖及其衍生物，由于在自然界中存在量極少，學術界把它們稱為稀少糖(Rare?Sugar)。隨著人們對這類糖的逐步了解，以阿洛酮糖與塔格糖為核心的功能性稀少糖研究得到迅速的發展。研究表明，阿洛酮糖的甜味類似于蔗糖，易溶于水，不參加體內代謝，無熱量；同時還具有許多獨特的生理學功能。例如，使用D-阿洛酮糖代替蔗糖等傳統甜味劑開發生產的牛乳布丁，具有更高的自由基清除和還原能力(Y.Sun，etal，2006，Biosci.Biotech.Biochem.，70：2859-2867)。因此，阿洛酮糖等稀少糖可以作為特殊人群理想的蔗糖替代品，在食品、保健品及醫藥品領域有著十分重要的應用價值。

目前，生產稀少糖的技術主要包括化學合成法、提取法和生物轉化法。但稀少糖在自然界中的含量極低，提取法明顯不適宜稀少糖的大規模生產；化學合成法不僅成本高、產量低，而且會產生比較嚴重的環境污染。生物轉化法可以利用自然界中廣泛存在的單糖或富含某些單糖的加工副產物為原料，不僅成本較低，而且轉化效率要遠遠高于前兩種方法，是規模化制備功能性稀少糖的重要技術手段。

日本的研究學者Izumofi于2002年建立了稀少糖的生物轉化生產策略，即Izumoring方法，該方法中利用酮糖差相異構酶(ketose?epimerase)、醛糖異構酶(aldose?isomerases)和多元醇脫氫酶(poly?dehydrogenase)進行所有單糖及糖醇之間的相互轉化，從而利用廉價的原料制備各種稀少糖(K.Izomuri，2006，J.Biotechnol.，124：717-722)。Izumoring策略提示給我們D-阿洛酮糖的生物轉化方法，即利用食品工業中加工副產物淀粉為原料經過現有成熟工藝獲得D-果糖，再通過D-塔格糖-3-差相異構酶(D-tagatose?3-epimerase，DTE)的作用獲得D-阿洛酮糖。該方法利用自然界中廣泛存在的廉價原料生產阿洛酮糖，大幅降低了成本，為D-阿洛酮糖的工業化大規模生產奠定了理論基礎。

日本香川大學稀有糖研究中心首次發現了DTE酶。該小組在研究假單胞菌Pseudomonascichorii?ST-24的D-山梨糖酵解過程中，發現了一種新型的酶，該酶的最適底物為D-塔格糖，遂將其命名為D-塔格糖-3-差相異構酶。該酶能夠催化己酮糖之間的差相異構反應，如D-塔格糖和D-山梨糖，D-果糖和D-阿洛酮糖之間的相互轉化(K.Izomuri，et?al，1993，Biosci.Biotech.Biochem.，57：1037-1039)。研究人員分離純化了該酶，對其N-末端氨基酸序列進行了質譜測序，進而獲得了該酶的基因序列。隨后，韓國希杰第一制糖株式會社的Oh等人從根癌農桿菌(Agrobacteriumtumefaciens?ATCC?33970)中克隆得到了新型的DTE基因，并在大腸桿菌中進行了異源表達(H.J.Kim，et?al，2006，Appl.Environ.Microbiol.，72：981-985)。通過對酶動力學以及酶活性質的研究發現，該酶的最適底物并不是D-塔格糖，而是D-阿洛酮糖，于是將該酶的名稱改為D-阿洛酮糖-3-差相異構酶(DPE)。該研究發現已于2006年申請了國際專利。我國江南大學的Zhang等人從魚塘淤泥中分離純化得到的類球紅細菌(Rhodobacter?sphaeroides?SK001)中克隆得到了DTE的基因，并對重組DTE的性質進行了進一步的研究(L.Zhang，et?al，2009，Biotechnol.Lett.，31：857-862)。但到目前為止，有專利或文獻報道的DTE基因只有以上三種，發現新型的DTE基因將是D-阿洛酮糖生物轉化法生產的關鍵。

【發明內容】：本發明的目的之一是提供從梭菌Clostridium?cellulolyticum中分離的編碼D-塔格糖3-差向異構酶的核苷酸序列。

本發明的目的之二是提供該核苷酸序列所編碼的D-塔格糖3-差向異構酶多肽。

本發明的目的之三是提供含有該基因核苷酸序列與異源調節序列連接，進行功能性表達的重組表達載體。