[發(fā)明專利]一種節(jié)球藻毒素多抗免疫親和柱的制備和使用方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201010258533.1
• 申請(qǐng)日: 2010-08-13
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102109515A
• 公開(kāi)（公告）日: 2011-06-29
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 肖付剛;呂春霞;王德國(guó);劉海英;高雪麗;張曉偉;郭衛(wèi)蕓;李凌樂(lè)
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 許昌學(xué)院;肖付剛
• 主分類號(hào): G01N33/531
• 分類號(hào): G01N33/531;G01N30/00;G01N30/08
• 代理公司: 暫無(wú)信息
• 代理人: 暫無(wú)信息

技術(shù)領(lǐng)域

一種節(jié)球藻毒素多抗免疫親和柱的制備和使用方法，屬于免疫親和層析及節(jié)球藻毒素檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

近年來(lái)人類由于生產(chǎn)、生活活動(dòng)的發(fā)展，向水體中大量排放廢物廢水，使得水體富營(yíng)養(yǎng)化，藻類大量繁殖，其中有毒藻的數(shù)量也急劇增多。我國(guó)的飲用水源地如太湖、巢湖、滇池等湖泊，一些水庫(kù)、河流等均受到藍(lán)藻水華的侵襲。2007年4月發(fā)布的《長(zhǎng)江保護(hù)與發(fā)展報(bào)告》稱，2003年三峽庫(kù)區(qū)蓄水至135米之后，12條長(zhǎng)江一級(jí)支流在回水區(qū)不同程度地出現(xiàn)水華現(xiàn)象，并且近幾年有加劇的趨勢(shì)。

自1878年Francis首次報(bào)道節(jié)球藻對(duì)牲畜的毒性作用后。在世界各地均有藻類水華引起家畜和野生動(dòng)物死亡以及人群的肝損害、胃腸炎、腹瀉和皮炎等事件的報(bào)道。

節(jié)球藻毒素(以下簡(jiǎn)稱NODLN)是藍(lán)藻水華腐爛后釋放于水中的毒素之一。NODLN為環(huán)狀五肽肝毒素，是絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶1(PP1)和蛋白磷酸酶2A(PP2A)的抑制劑。最新的研究表明，NODLN同時(shí)為腫瘤誘發(fā)劑和促進(jìn)劑，而微囊藻毒素-LR(以下簡(jiǎn)稱MC-LR)僅為腫瘤促進(jìn)劑。因?yàn)镸C-LR毒性強(qiáng)于NODLN，因此MC-LR研究較多，WHO和我國(guó)GB?5749-2006生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定飲用水中MC-LR的限量為1μg/L。而飲用水中還未有NODLN的限量標(biāo)準(zhǔn)。鑒于NODLN促腫瘤作用強(qiáng)于MC-LR，飲用水中NODLN的限量標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)低于MC-LR。

免疫親和柱(IAC)是利用免疫親和層析原理制作的分離分析預(yù)裝柱。由于抗體與抗原作用具有高度專一性，因此通過(guò)IAC凈化能夠去除絕大部分雜質(zhì)。IAC技術(shù)已日漸成熟，在與藻毒素類似的真菌毒素的檢測(cè)中已廣泛應(yīng)用，其中黃曲霉毒素的免疫親和層析已被列入國(guó)標(biāo)中(GB18980-2003和GB18979-2003)。

目前NODLN的毒性和促腫瘤作用還未引起足夠重視，檢測(cè)方法只見(jiàn)于外文報(bào)道。我們的前期研究表明，水中NODLN的檢測(cè)可用HPLC和LC-MS法，因含量低，在進(jìn)樣前，一般用固相萃取柱(SPE)富集，但是SPE無(wú)特異性，水中雜質(zhì)多，富集后會(huì)引入許多雜質(zhì)，干擾檢測(cè)結(jié)果，特別是HPLC法，有時(shí)測(cè)定值與實(shí)際值相去甚遠(yuǎn)。LC-MS法雖然檢測(cè)限低，測(cè)定結(jié)果較準(zhǔn)確，但是價(jià)格昂貴，一般實(shí)驗(yàn)室沒(méi)有。

利用本發(fā)明所研制的IAC，通過(guò)一次凈化即可除去絕大部分雜質(zhì)，直接進(jìn)HPLC就能獲得準(zhǔn)確的結(jié)果，能夠滿足NODLN日常監(jiān)測(cè)的需求。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種NODLN多抗免疫親和柱的制備和使用方法，所研制的IAC是將NODLN的多抗固定于柱中，從而吸附樣品溶液中的NODLN，洗脫后起到富集和凈化的效果，然后進(jìn)HPLC進(jìn)行定性定量分析。作為前處理過(guò)程，IAC富集優(yōu)于現(xiàn)有的SPE法。

本發(fā)明的技術(shù)方案：一種NODLN多抗免疫親和柱的制備方法：

(1)以NODLN與牛血清白蛋白(BSA)偶聯(lián)，得到的偶聯(lián)物(以下簡(jiǎn)稱NODLN-BSA)作為人工抗原，兔疫獲得NODLN抗血清，再采用飽和硫酸銨二步沉淀法純化獲得NODLN多抗；

(2)瓊脂糖凝膠Sepharose?4B的活化：用溴化氰法活化瓊脂糖凝膠Sepharose?4B，活化過(guò)程如下：

(a)取10mL?Sepharose?4B放在布氏漏斗中抽干，用30mL水分兩次洗滌后抽干，加少量的0.1mol/L?pH?8.3的NaHCO₃洗滌，立即轉(zhuǎn)入100mL燒杯中，冰浴下緩慢攪拌；

(b)在通風(fēng)櫥內(nèi)稱取1g溴化氰，加水10mL溶解，然后分批加入Sepharose?4B中，邊加邊攪拌，同時(shí)測(cè)pH值，通過(guò)滴加2mol/LNaOH，使pH保持在10.5，待溴化氰反應(yīng)完全，pH保持不變，停止攪拌；

(c)將活化的Sepharose?4B加入小冰塊，迅速倒入布氏漏斗中，以冰水抽洗成中性，再迅速以150mL冷的0.1mol/L?pH?8.3的NaHCO₃抽洗；

(3)NODLN多抗免疫親和柱的制備：

NODLN多抗與瓊脂糖凝膠Sepharose?4B偶聯(lián)得到親和吸附劑，填入柱中制得NODLN多抗免疫親和柱，操作步驟如下：

(d)偶聯(lián)