[發明專利]一種HLA基因分型的PCR-SBT方法及其試劑

有效

• 申請號: 201010256435.4
• 申請日: 2010-08-18
• 公開（公告）號: CN101928776A
• 公開（公告）日: 2010-12-29
• 發明（設計）人: 朱發明;章偉;嚴力行
• 申請（專利權）人: 浙江省血液中心
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 浙江杭州金通專利事務所有限公司 33100
• 代理人: 劉曉春

技術領域

本發明涉及基因分型檢測方法及其試劑，尤其涉及一種用于HLA-A、B、C位點1-7外顯子基因分型的分子生物學檢測方法及其試劑。

背景技術

人類白細胞抗原（HLA）基因位于第6號染色體短臂21.3區域，是調控人體特異性免疫應答的主要基因系統，是目前所知的最富多態性的遺傳系統。HLA抗原與同種器官移植的排斥反應密切相關，器官移植術后移植物能否存活很大程度上取決于供者與受者之間HLA型別是否相合。HLA位點分型對選擇合適的供體、降低移植物抗宿主病（GVHD）的發生率、提高移植物的存活率均有重要意義。

HLA-A、-B、-C座位基因為經典的HLA-Ⅰ類基因，具有高度遺傳多態性，廣泛表達在各種有核細胞表面。編碼HLA-HLA-A、-B、-C的基因具有相似的基因結構，一般含有7個內含子和8個外顯子，其大小約為3.5kb。第1外顯子編碼前導鏈，第2、3、4外顯子分別編碼α鏈的α1、α2、α3結構域，第5外顯子編碼連接多肽和跨膜區蛋白，第6、7、8外顯子分別編碼胞內區域和非翻譯區蛋白。HLA-A、-B、-C的多態性主要由編碼α1、α2區的第2、3外顯子決定，但是在第1、4、5、6、7外顯子上也有一定的多態性。

HLA分型技術已廣泛應用于多個領域，如HLA多態性的研究、HLA的生物學功能、器官和骨髓移植前供受者組織相容性配型、HLA與某些疾病的關聯、親子鑒定以及人類遺傳學等方面。HLA的分型技術主要有血清學分型技術、細胞學分型技術、基因分型技術等。個體HLA遺傳學差異的本質在于編碼其抗原產物的基因上，所以分析個體HLA的基因型無疑是對HLA型別分析的最準確的方法，其準確性遠高于血清學與細胞學分型。目前以DNA為基礎的HLA基因分型技術日趨成熟，并逐漸取代血清學方法和細胞學分型技術。基因分型方法具有獨特的優點：需要的血樣少，標本可長期保存，相應的分型試劑可大量制備，來源不受限制。特別重要的是基因分型精確可靠，重復性好，其分型錯誤率遠低于血清學方法，基因分型技術已在實際工作中得到了廣泛的應用。

HLA的基因分型方法基本上可分為兩種類型。一類是以鑒別HLA基因序列不同為基礎的HLA分型技術，如序列特異性引物PCR（polymerase?chain?reaction?sequence?specific?primer,?PCR-SSP）、序列特異性寡核苷酸探針分型技術（polymerase?chain?reaction??sequence?specific?oligonucleotide??probe,?PCR-SSO）、單核苷酸序列分析（PCR?sequence?base-typing，PCR-SBT）、基因芯片、流式細胞術（Luminex）等。另一類基于不同HLA等位基因在聚丙烯酰胺凝膠電泳中具有不同的構象而設計的。實際工作中一般采用PCR-SSP、PCR-SSO、PCR-SBT、基因芯片、流式細胞術等技術，其中HLA分型的直接測序方法（PCR-SBT）是最準確的HLA分型方法，也是目前的金標準方法。但現階段的HLA-A、B、C位點PCR-SBT分型方法主要針對多態性位點比較集中的2、3、4號外顯子的測定來確定其基因型，而對第1、5、6、7號外顯子不進行測序，由于HLA高度遺傳多態性，在第1、5、6、7外顯子上也有一定的多態性，因此現有的方法測定2-4外顯子多態性，可能引起部分等位基因無法指定，存在歧義或錯誤的結果，嚴重影響臨床工作。

發明內容

本發明首先所要解決的技術問題是提供一種HLA基因分型的PCR-SBT方法，以克服現有HLA-A、B、C位點分型技術中的上述缺陷。為此，本發明采用以下技術方案：?它對HLA-A位點1-7外顯子、HLA-B位點1-7外顯子、HLA-C位點1-7外顯子進行基因分型，包括以下步驟：

（1）、制備人基因組DNA；

（2）、設計擴增引物，用聚合酶鏈反應分別擴增人基因組DNA中HLA-A、HLA-C位點基因外顯子1-8全長序列和HLA-B位點基因外顯子1-7全長序列；

（3）、將步驟（2）得到的擴增產物進行雙酶切純化；

（4）、設計測序引物，將步驟（3）得到的純化產物進行測序PCR反應；

（5）、將步驟（4）得到的測序產物進行醋酸鈉-乙醇沉淀法純化，進行毛細管電泳測序；

（6）、將步驟（5）獲得的序列通過軟件分析，確定其基因型。