[發明專利]非傳播抗豬瘟和乙腦基因工程雙價標記減毒活疫苗及應用

有效

• 申請號: 201010253413.2
• 申請日: 2010-08-11
• 公開（公告）號: CN101934076A
• 公開（公告）日: 2011-01-05
• 發明（設計）人: 潘茲書;楊振華;張楚瑜
• 申請（專利權）人: 武漢大學
• 主分類號: A61K39/295
• 分類號: A61K39/295;C07K19/00;C12N15/62;A61P31/14;C12R1/93
• 代理公司: 武漢科皓知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 42222
• 代理人: 張火春

技術領域

本發明屬于基因工程技術領域。本發明涉及一種非傳播抗豬瘟和乙腦基因工程雙價標記減毒活疫苗及其構建方法，同時涉及該疫苗在預防豬瘟和乙型腦炎中的應用。

技術背景

豬瘟是豬的一種傳染性極強的病毒性疾病，早期稱為豬霍亂(Hog?Cholera，HC)，可感染各年齡階段豬，一年四季流行，發病率和死亡率均很高，危害巨大。豬瘟的病原體是豬瘟病毒(Classical?swine?fever?virus，CSFV)，在國際獸疫局(OIE)制定的《國際動物衛生法典》中，豬瘟被列入A類16種法定報告的傳染病之一。我國近年來豬瘟頻繁爆發流行，給養豬業造成了嚴重經濟損失，妨礙了畜牧業的發展和出口貿易，提高對豬瘟的預防和控制水平是科技工作的重大課題。

CSFV基因組長為約12.3kb的單股正鏈RNA，由5′端非編碼區(5′Untranstaledregion，5′UTR)、一個大的開放閱讀框架(ORF)和3′端非編碼區(3′UTR)構成。ORF編碼一個由3898個氨基酸殘基組成的多聚蛋白，多聚蛋白在翻譯過程中或翻譯后，被病毒自身編碼的蛋白酶和宿主細胞的蛋白酶加工成12種成熟蛋白質，包括4種結構蛋白C、E^rns、E1、E2和8種非結構蛋白N^pro、P7、NS2、NS3、NS4A、S4B、NS5A和NS5B。其中，E2蛋白是CSFV的跨膜糖蛋白，介導病毒的吸附與入侵，是CSFV毒力相關因子和保護性抗原蛋白之一。CSFV感染機體能誘導機體產生高滴度E2抗體。E2常以同源二聚體或E1E2異源二聚體存在于病毒粒子和宿主細胞的表面；E2與下游的P7蛋白有時加工切割不完全，在CSFV感染的細胞中可以發現E2p7這種穩定的中間體。

早在1951年，我國研究人員篩選出免疫原性優良的CSFV石門毒株(殷震，1997)，該毒株作為中國CSFV標準強毒株沿用至今。當時使用CSFV石門毒株，滅活制成豬瘟結晶紫甘油滅活疫苗，使用后迅速控制了國內的豬瘟疫情。1954-1956年間，中國獸藥監察所等單位的研究人員將CSFV強毒株(其中包括標準強毒石門株)適應家兔，在兔體連續傳代，選育出一株對豬基本無毒力，并保持CSFV免疫原性的兔化毒株，即中國豬瘟兔化弱毒疫苗株(hog?cholera?lapinized?vaccine，HCLV)。豬瘟兔化弱毒疫苗的成功研制和應用，對我國豬瘟的預防和控制起了決定性作用。然而，近50年來豬瘟兔化弱毒疫苗的廣泛使用，并未控制豬瘟的發生。近年來，我國豬瘟的發生出現了許多新特點，表現為從頻發的大流行轉變為無規律的散發流行；臨床癥狀從典型變為非典型豬瘟，病毒毒力降低，病程由急性、亞急性轉變為以慢性為主，出現持續感染、胎盤感染、母豬繁殖障礙以及新生仔豬的先天性感染等。盡管疫苗的免疫劑量和免疫次數增加，仍不能控制豬瘟的發生，而且呈蔓延趨勢。其中，豬瘟兔化弱毒疫苗接種與CSFV野毒感染豬不能用血清學檢測方法相區分，無法剔除CSFV野毒感染豬，一旦發生感染，病毒長期存在，是導致豬瘟散發流行的主要原因之一。豬瘟的發生、傳播和流行是嚴重制約我國養豬業健康發展、增加農民收入和發展國際貿易的瓶頸。為滿足我國對豬瘟預防、控制和最終根除的需要，研制新一代豬瘟疫苗制品以替代傳統的豬瘟兔化弱毒疫苗，勢在必行。

流行性乙型腦炎，又稱日本腦炎(Japanese?encephalitis，JE)，是一種自然疫源性人畜共患的急性傳染病，由乙型腦炎病毒(Japanese?encephalitis?virus，JEV)感染引起，通過蚊為媒介傳播，以高熱和狂暴或沉郁等中樞神經癥狀為特征。JEV與CSFV同屬黃病毒科成員，其基因組為約11kb大小的單股正鏈RNA分子，由5′端非編碼區、大的開發閱讀框(ORF)和3′端非編碼區組成。ORF??依次編碼C-PreM-M-E-NS1-NS2a-NS2b-NS3-NS4a-NS4b-NS5等11種蛋白質。其中，E蛋白是JEV的主要結構蛋白，由500個氨基酸組成，它在病毒的吸附、融合、血凝、細胞趨向性、病毒毒力和誘導保護性免疫反應中起重要作用。早期研究結果表明，E蛋白的保護性抗原表位集中在蛋白質結構域III的氨基酸序列內(位于E蛋白第292-402位氨基酸)[Virology，1999，26：31-42；Vaccinc，2003，21：2516-2522]。