[發明專利]一種雙向誘導表達質粒、其構建方法和用途

無效

• 申請號: 201010239252.1
• 申請日: 2010-07-28
• 公開（公告）號: CN102337283A
• 公開（公告）日: 2012-02-01
• 發明（設計）人: 李旭東;郝純;楊俊仕;劉慶華
• 申請（專利權）人: 中國科學院成都生物研究所
• 主分類號: C12N15/63
• 分類號: C12N15/63;C12N15/65;C12N1/21;C12Q1/68
• 代理公司: 成都賽恩斯知識產權代理事務所(普通合伙) 51212
• 代理人: 肖國華

技術領域

本發明屬于分子生物學技術領域，具體涉及一種雙向誘導表達質粒及其構建方法和用途。

技術背景

從環境元基因組文庫中篩選具有催化作用的基因避開了微生物純培養的限制，該方法具有廣闊的應用前景。底物誘導基因表達篩選技術(Substrate-induced?gene-expressionscreening，SIGEX)由于使用了高度自動化的流式細胞術(Flow?Cytometry，FCM)，所以具有省時省力、效率高、能篩選到較新穎的基因等優點，其研究也越來越受到重視。SIGEX技術的理論基礎是催化基因的表達常常受其底物或者代謝產物的誘導，并常常受各種調節元件的控制。許多細菌的轉錄調節與宿主菌(E.coli)具有相似的轉錄調節機制并能在一起工作，這樣，通過SIGEX技術可以篩選到各種細菌內的催化操縱子。SIGEX技術對環境元基因組文庫的篩選主要分為建庫、預篩選、底物誘導并陽性克隆篩選三個步驟，其中，用于建庫機篩選的可誘導表達質粒載體是該技術的核心和基礎。現在已有的可誘導表達質粒載體p18GFP包含了一個綠色熒光蛋白(Green?Fluorescent?Protein，GFP)報告基因(Taku?Uchiyama等，naturebiotehnology，23(1)，88-93，2005)，但是由于核酸是雙鏈結構并能雙向表達，所以現有的可誘導表達質粒載體不能完全報告出克隆于該載體上的可誘導表達的基因片段。構建一個可被雙向誘導表達的質粒載體，并在克隆位點正向和反向的下游區都設計上一個報告基因，可以使克隆于該載體上正反兩個方向可受誘導的基因片段均得到報告，提高SIGEX的篩選效率。

發明內容

本發明的目的之一是提供一種同時含有綠色熒光蛋白基因和增強型綠色熒光蛋白基因的雙向誘導表達質粒。

本發明的目的之二是提供上述雙向誘導表達質粒的構建方法。

本發明的目的之三是提供上述雙向誘導表達質粒的用途。

本發明的雙向誘導表達質粒是一種同時含有綠色熒光蛋白基因和增強型綠色熒光蛋白基因的質粒。

本發明采用基因重組的方法，使綠色熒光蛋白基因與增強型綠色熒光蛋白基因置于一個酶切位點兩邊并分別在各自的啟動子的調控下，獲得雙向誘導表達質粒。

在酶切位點處連接可誘導基因，并轉化大腸桿菌得到基因工程菌后，接種于培養基，經誘導生長培養后表達。

該雙向誘導表達質粒作為載體構建某種基因組文庫后，可用于底物誘導的基因表達篩選及環境因素誘導基因表達篩選。

該雙向誘導表達質粒轉化的宿主菌可以是大腸桿菌E.coli?JM109、E.coli?DH5α。

該質粒轉化大腸桿菌后可得到含該雙向誘導表達質粒的菌種，該菌種已于2010年7月14日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏號為CGMCC?NO.4004，分類命名為大腸埃希氏菌Escherichia?coli。

保存該雙向誘導表達質粒的方法：將其轉化進入大腸埃希菌Escherichia?coli，于0℃以下保存，或者溶于重蒸水中，于0℃以下保存。

本發明提供雙向誘導表達質粒，用于SIGEX可以使克隆于該載體上正反兩個方向可受誘導的基因片段均得到報告，提高SIGEX的篩選效率。

附圖說明

圖1為雙向誘導表達質粒p18BG的示意圖

圖2為SIGEX技術對環境元基因組文庫的篩選流程

圖3為雙向誘導表達質粒p18BG的構建流程

圖4為流式細胞儀對環境元基因組文庫預篩選圖

圖5為流式細胞儀對經預篩選并誘導后的環境元基因組文庫篩選圖

具體實施方式

下面通過構建雙向誘導表達質粒p18BG對本發明作進一步闡述，但并不限制本發明的范圍。

重組質粒p18BG的構建：