[發(fā)明專利]一種豬瘟兔化弱毒活疫苗效力檢驗方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201010237929.8
• 申請日: 2010-07-28
• 公開（公告）號: CN101915837A
• 公開（公告）日: 2010-12-15
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 戴志紅;王在時;關(guān)孚時;蔣卉;李翠;陸連壽;溫芳;趙耘;秦玉明
• 申請（專利權(quán)）人: 中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569;C12Q1/70;C12Q1/02
• 代理公司: 北京君智知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所 11305
• 代理人: 鄭明

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種豬瘟兔化弱毒活疫苗效力檢驗方法，屬于獸用生物制品技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

豬瘟(Classical?Swine?Fever，CSF)是由豬瘟病毒(Classical?Swine?Fever?Virus，CSFV)引起的一種高度接觸性、致死性的豬傳染病，在世界上很多國家和地區(qū)均有發(fā)生，給畜牧業(yè)生產(chǎn)帶來了嚴重的經(jīng)濟損失。世界動物衛(wèi)生組織(OIE)將豬瘟列為法定通報性疫病，我國將其劃為一類動物傳染病。

長期以來，豬瘟兔化弱毒活疫苗免疫一直是世界上廣為采用的最有效、經(jīng)濟的豬瘟控制方法。我國研制和使用豬瘟兔化弱毒活疫苗已有近50年歷史，并為世界上許多國家豬瘟的控制和消滅做出了重要貢獻。目前，我國實行強制免疫豬瘟弱毒活疫苗作為控制豬瘟的主要手段。疫苗質(zhì)量無疑是保證豬瘟防控效果的最關(guān)鍵因素，而保證疫苗質(zhì)量的最重要環(huán)節(jié)是效力檢驗，因此效力檢驗則是重中之重。根據(jù)已有的方法，豬瘟兔化弱毒活疫苗的效力檢驗可以采用家兔或豬進行。用家兔效檢，每批疫苗約需7天，實驗結(jié)果易受家兔品種和個體差異影響，且勞動強度大；用豬效檢，每批疫苗需豬7頭，并且預(yù)先需用兔體中和試驗對實驗豬進行抗體檢測，耗時約需3周。由此可見，兩種效檢方法均存在很大不足，亟需進一步改進提高。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種豬瘟兔化弱毒活疫苗效力檢驗方法。本發(fā)明是通過以下技術(shù)路線來實現(xiàn)的：

1.建立豬瘟兔化弱毒活疫苗的病毒效價測定方法是：(1)選擇細胞系用于測定疫苗的病毒效價；(2)細胞的傳代與培養(yǎng)：將上述細胞消化并用培養(yǎng)液制成細胞懸液，接種24孔組織培養(yǎng)板，在CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)成單層細胞；(3)將疫苗10倍系列稀釋后接種至細胞培養(yǎng)板，同時設(shè)立陰性、陽性對照；(4)病毒吸附后加入維持液在CO₂培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)3天；(5)培養(yǎng)結(jié)束時，用固定液固定細胞；(6)用標記的豬瘟特異性抗體進行免疫染色；(7)觀察結(jié)果，計算病毒效價(TCID₅₀/0.1ml)。

2.通過實驗證實病毒效價與兔體試驗或與豬體試驗之間的數(shù)量關(guān)系；

3.實現(xiàn)對疫苗進行體外效力檢驗，最終根據(jù)數(shù)量關(guān)系計算和判定結(jié)果。

本發(fā)明的詳細描述：

一、試劑、材料

1?豬瘟病毒參考毒株

豬瘟病毒兔化弱毒株(C株)、豬瘟病毒石門強毒株，由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所鑒定、保存和提供。

2?細胞系

本發(fā)明所用的細胞系為豬腎細胞(PK-15或SK-6)、豬睪丸細胞(ST)、牛腎細胞(MDBK)、牛睪丸細胞(BT)、兔腎細胞(RK-13)和/或其他豬瘟病毒兔化弱毒株適應(yīng)的細胞系中的一種細胞(均來自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所)，需要按照《中華人民共和國獸用生物制品規(guī)程》(中華人民共和國農(nóng)業(yè)部.中華人民共和國獸用生物制品規(guī)程.二○○○年版.化學(xué)工業(yè)出版社，2001，本發(fā)明以下簡稱《規(guī)程》)和/或《中華人民共和國獸藥典》(中國獸藥典委員會.中華人民共和國獸藥典二○○五年版三部.中國農(nóng)業(yè)出版社，2005，本發(fā)明以下簡稱《中國獸藥典》)要求檢測不含外源病毒。

3?細胞培養(yǎng)液

90％～95％MEM(或DMEM)+5～10％的胎牛血清(新生牛血清)，pH調(diào)至7.0～7.4。

4?細胞維持液

98％MEM(或DMEM)+2％的胎牛血清(新生牛血清)+雙抗(青霉素和鏈霉素，終濃度各100IU/ml，以下同)，pH調(diào)至7.2～7.4。

5?稀釋液

99％MEM(或DMEM)+雙抗(終濃度各100IU/ml)。

6?固定液

50％丙酮-甲醇溶液(50％丙酮+50％甲醇)或80％丙酮水溶液(80％丙酮+20％水)。

7?抗體

本發(fā)明所涉及的豬瘟特異性抗體為熒光或酶標記的豬瘟單克隆抗體、熒光或酶標記的豬瘟多克隆抗體，熒光或酶標記的第二抗體(二抗)與豬瘟單克隆抗體或多克隆抗體聯(lián)用。以上豬瘟多克隆抗體為豬源或兔源。

8?DAB顯色液

(1)0.05M?TB：0.2M?Tris-HCl?133ml加NaCl?6.20g，加去離子水至400ml，調(diào)至pH?7.6；

(2)DAB顯色液：DAB?500mg加入100ml?0.05M的TB中(先以少量TB溶解DAB，然后加入余量TB，充分搖勻)過濾后備用；

(3)顯色前加入30％的H₂O₂30～40μl，使其終濃度為0.01％。

9?實驗動物