[發明專利]滾環擴增加跨缺口熒光定量PCR檢測乙型肝炎病毒cccDNA試劑盒

有效

• 申請號: 201010237281.4
• 申請日: 2010-07-22
• 公開（公告）號: CN101948932A
• 公開（公告）日: 2011-01-19
• 發明（設計）人: 鐘彥偉;徐東平;韓佳琪;蘇何玲;任曉強
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍第三〇二醫院
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;G01N21/64
• 代理公司: 北京海虹嘉誠知識產權代理有限公司 11129
• 代理人: 王素菊

技術領域：

本發明涉及一種乙型肝炎病毒cccDNA定量檢測的方法，特別是涉及采用滾環擴增加跨缺口熒光定量PCR技術定量檢測乙型肝炎病毒共價閉合環狀DNA的方法；本發明還涉及利用此方法研制的乙型肝炎病毒cccDNA檢測試劑盒。

背景技術：

乙型肝炎病毒共價閉合環狀DNA(covalently?closed?circular?DNA，以下簡稱為HBV?cccDNA)是乙肝病毒感染宿主細胞后在細胞內復制并建立感染狀態，病毒松弛環狀DNA(relaxed?circular?DNA，rcDNA)進入細胞核，利用宿主DNA聚合酶和拓撲酶等“修復”形成的結構完整的、超螺旋雙鏈DNA分子。

目前HBV?cccDNA檢測主要方法為熒光探針檢測技術，通過選擇性擴增HBVcccDNA，使檢測的靈敏度和實用性得到明顯提高，根據對模板的擴增方法不同分為兩類：一是跨缺口實時熒光定量PCR技術(PSAD酶降解非閉合環狀DNA法，不降解質粒的ATP依賴的DNA酶Plasmid?safe?ATP-dependent?DNase，簡稱為PSAD)，二是Invader技術，二者均可通過熒光標記探針進行HBV?cccDNA的定量檢測。

PCR技術的基本原理是采用跨rcDNA缺口區引物擴增cccDNA，但為防止rcDNA在PCR退火過程中形成可被擴增的模板，需在擴增前用PSAD消化非閉合環狀DNA或采用特殊設計的嵌合引物特異性擴增cccDNA。Invader法的基本原理是通過一條與模板完全互補的Invader探針和一條與模板部分互補的初級探針，后者與模板互補部分與前者的3’端緊鄰；當探針與模板雜交后形成一個部分重疊的結構，進而初級探針上5’端與模板不互補的部分被酶切割產生被稱作5’flap的核苷酸短鏈；在特定溫度下，這一過程可以循環反復，所產生的5’flap按比例地將模板信號放大，并被檢測5’flap的熒光標記探針捕獲。

上述方法存在以下幾個問題：

1、檢測的特異性和靈敏度不強

HBV?cccDNA主要存在于肝細胞核中。由于HBV?cccDNA的含量通常遠遠低于HBV松馳環狀DNA(rcDNA)，跨缺口實時熒光PCR方法和Invader方法難以保證檢測的特異性和靈敏度。

2、Invader技術和跨缺口實時熒光定量PCR技術無法區分整合DNA和cccDNA

HBV慢性感染特別是肝硬化患者肝組織中存在大量整合HBV?DNA，即使采用目前先進的PSAD酶消化非閉合環狀DNA，仍不能保證非閉合環狀DNA被完全徹底消化，也不能有效區別cccDNA和整合HBV?DNA。

3、不能有效區分整合DNA、松馳環狀DNA(rcDNA)和閉合環狀DNA(cccDNA)。

4、樣本間的差異干擾數據分析，沒有內參進行標準化。

如北京索奧生物醫藥科技有限公司生產的“乙型肝炎病毒cccDNA檢測試劑盒”，上海復星醫藥集團出品的“HBV?cccDNA?PCR熒光定量檢測試劑盒”，均為直接PCR擴增，不進行PSAD酶消化和滾環擴增環節，而且無內參照，不能消除不同樣本間的差異，特異性和靈敏度低。