[發(fā)明專利]一種豬鏈球菌2型分泌核酸酶SsnA基因及制備方法與應用

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201010231567.1
• 申請日: 2010-07-15
• 公開（公告）號: CN101935668A
• 公開（公告）日: 2011-01-05
• 發(fā)明（設計）人: 金梅林;康超;張安定;李冉;滑亞峰
• 申請（專利權(quán)）人: 華中農(nóng)業(yè)大學;武漢科前動物生物制品有限責任公司
• 主分類號: C12N15/55
• 分類號: C12N15/55;C12N9/22;C12N15/70;C12N1/21;G01N33/569;C12R1/19
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務所 42001
• 代理人: 王敏鋒

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于動物傳染病技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種分泌核酸酶SsnA基因的分離和克隆，將所述的基因通過大腸桿菌表達，獲得重組大腸桿菌菌株(Escherichia?coli)BL21/PET28a-SsnA)，利用該菌株表達豬鏈球菌2型分泌核酸酶SsnA，并建立酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)鑒別診斷方法，用于區(qū)分豬鏈球菌2型滅活疫苗免疫豬與感染豬。本發(fā)明提供含有豬鏈球菌2型分泌核酸酶SsnA的表達質(zhì)粒(pET-28a(+))、重組大腸桿菌菌株(Escherichia?coli)BL21/PET28a-SsnA、SsnA蛋白的表達和純化方法以及用該蛋白建立的可區(qū)分豬鏈球菌2型滅活苗免疫豬血清和感染豬血清的鑒別診斷方法。

背景技術(shù)

豬鏈球菌(Streptococcus?suis，S.suis)是引起豬鏈球菌病的主要病原，依據(jù)豬鏈球菌表面的莢膜多糖(CPS)可以將S.suis分為35個血清型，分別為1/2型和1～34型，但最近也有人提出32型和34型應該歸于Streptococcus?orisratti，而不應該歸于豬鏈球菌。在豬鏈球菌35個血清型中，豬鏈球菌2型(SS2)是流行最廣的病原(Hill?J.et?al.，2005)。該型亦是臨床分離頻率最高的血清型。SS2是一種重要的人畜共患病病原體，能引起豬腦膜炎(meningitis)、心內(nèi)膜炎(endocarditi)、敗血癥(septicemia)、關(guān)節(jié)炎(arthritis)、漿膜炎(polyserositis)、肺炎(pneumonia)等，常引起斷奶仔豬或育肥豬突然死亡；人類感染該菌，可導致腦膜炎，引發(fā)永久性耳聾、敗血癥、心內(nèi)膜炎，甚至死亡(Vecht?U?et?al.，1985；Clifton-Hadley?FA，1983；Gottschalk?M?et?al.，2000)。我國于1991年在廣東省首次報道了該病的發(fā)生。1998-1999年夏季在我國江蘇省部分地區(qū)豬群中暴發(fā)流行，并導致特定人群致死的疫病由豬鏈球菌2型所引起。2005年夏季，四川省多個地區(qū)發(fā)生豬鏈球菌2型病疫情，造成500多頭生豬死亡，人感染200多例，死亡30多例，進一步證實該病已在我國開始廣泛流行。

由于對豬鏈球菌的致病機制還不清楚，無有效的檢測和診斷方法，在很多國家豬鏈球菌一直未得到有效的控制。特別是對豬鏈球菌抗體檢測的方法國內(nèi)外一直無商品化的試劑盒，對于感染和免疫無法進行有效的區(qū)分。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，其第一個目的是分離和克隆豬鏈球菌2型分泌核酸酶SsnA基因片段。其第二個目的是利用所克隆的分泌核酸酶SsnA基因片段轉(zhuǎn)化大腸桿菌，獲得一種能特異性表達該分泌核酸酶SsnA的重組大腸桿菌。本發(fā)明的第三個目的是獲得一種蛋白，為豬鏈球菌2型的檢測診斷試劑盒和ELISA方法提供一種新抗原。

本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)：

申請人通過基因克隆方法，從豬鏈球菌2型中分離克隆得到一種分泌核酸酶SsnA基因片段，其核苷酸序列如序列表SEQ?ID?NO：1所示，序列長度為1131bp，其對應的氨基酸序列如序列表SEQ?ID?NO：2所示，包含377個氨基酸。將所述的分泌核酸酶SsnA基因片段轉(zhuǎn)化大腸桿菌，獲得一種包含豬鏈球菌2型分泌核酸酶SsnA基因并能表達該基因的重組大腸桿菌(Escherichia?coli)BL21/PET28a-SsnA，將該重組大腸桿菌于2010年6月24日送交湖北省武漢市武漢大學內(nèi)的中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)保藏，其保藏編號為：CCTCC?NO：M2010155。

1、重組大腸桿菌的制備步驟：

1)以豬鏈球菌2型(Streptococcus?suis2，SS2)基因組為模板，設計引物對，通過PCR方法擴增得到豬鏈球菌2型分泌核酸酶SsnA基因；該基因的部分核苷酸序列如SEQ?ID?NO：1所示；

2)將豬鏈球菌2型分泌核酸酶基因SsnA基因插入原核表達載體pET-28a(+)(購自Novagen公司)的BamHI和XhoI多克隆位點，構(gòu)建得到中間表達質(zhì)粒pET28a-SsnA；

3)將步驟2)的中間表達質(zhì)粒pET28a-SsnA轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21感受態(tài)細胞，用卡那霉素抗性篩選單個重組大腸桿菌，經(jīng)誘導(見后面的詳細過程所述)得到特異性地表達分泌核酸酶基因SsnA蛋白；

其中步驟1)所述的引物對的DNA序列如下所示：

正向引物：P15’-GTGGGATCCACTGAAGTGGCGATA-3’，