[發明專利]條斑星鰈精子冷凍保存方法

無效

• 申請號: 201010230929.5
• 申請日: 2010-07-20
• 公開（公告）號: CN101884322A
• 公開（公告）日: 2010-11-17
• 發明（設計）人: 柳學周;徐永江;劉新富;陳超;孫中之;王妍妍;曲建忠
• 申請（專利權）人: 中國水產科學研究院黃海水產研究所
• 主分類號: A01N1/02
• 分類號: A01N1/02
• 代理公司: 青島聯智專利商標事務所有限公司 37101
• 代理人: 袁和善

1.一種條斑星鰈精子冷凍保存方法，其特征在于它的方法內容包括：(1)、精液采集，(2)、基礎液選擇，(3)、抗凍劑選擇，(4)、精子的稀釋與平衡，(5)、精子冷凍，(6)、精子復蘇，(7)、凍精復蘇后的受精效果檢驗；

(1)、精液采集：選擇性腺發育成熟的雄性親魚，利用150mg/L的MS222麻醉后，采用腹部擠壓法獲取精液，以吸管和干燥的1.5ml離心管收集精液，精液采集后置于冰上保存，活動率85％以上的精液樣品用于精子冷凍；

(2)、基礎液選擇：選用Hank`s液作為基礎液，配制方法：CaCl₂·2H₂O0.185g/L，無水MgSO₄0.09767g/L，KCl?0.4g/L，Na₂HPO₄0.06g/L，NaCl?8g/L，NaH₂PO₄?0.04788g/L，D-葡萄糖1g/L，NaHCO₃0.35g/L，以1N?HCL調節pH至7.6，備用；

(3)、抗凍劑選擇：以基礎液終濃度的百分比15％DMSO+10％蛋黃作為抗凍保護劑；

(4)、精子的稀釋與平衡：將精液與預冷的4℃稀釋液按照體積比1∶2混合，然后按照要求的體積比加入抗凍劑，在冰上或4℃冰箱平衡4-6min；

(5)、精子冷凍：將平衡后的精液和稀釋液混合液按照每管1.8ml分裝入2ml凍存管中，按照三步降溫法進行冷凍保存；即液氮罐頸部約-15℃停留2min；液氮面上約4cm處約-160℃停留5min；再直接投入液氮中保存；

(6)、精子復蘇：解凍時，先將凍存管提至罐口，在液氮蒸汽中停留約3min，然后將冷凍管取出迅速置于28℃水浴中解凍60s，管中凍精外層開始融化，取出置于室溫下至完全融化；在室溫條件下，以自然海水激活精子，檢查精子活力；

(7)、凍精復蘇后的受精效果檢驗：人工采集成熟條斑星鰈卵子，以新鮮精液和解凍后復蘇精液分別進行人工授精；將受精卵置于循環流水孵化系統進行孵化，統計受精率和孵化率。