[發明專利]基于青海弧菌Q67的環境污染物長期微板毒性分析法

無效

• 申請號: 201010230715.8
• 申請日: 2010-07-20
• 公開（公告）號: CN101915759A
• 公開（公告）日: 2010-12-15
• 發明（設計）人: 朱祥偉;劉樹深;葛會林;張麗芬
• 申請（專利權）人: 同濟大學
• 主分類號: G01N21/76
• 分類號: G01N21/76;C12Q1/02
• 代理公司: 上海智信專利代理有限公司 31002
• 代理人: 吳林松

1.一種基于青海弧菌Q67的環境污染物長期微板毒性分析法，包括以下步驟：

(1)青海弧菌Q67普通培養基配制與培養：

(2)青海弧菌Q67的固體平板培養基配制：

(3)青海弧菌Q67菌種的配制與培養：

(4)青海弧菌Q67微板培養基的配制：

(5)微板加樣菌液的配制：

(6)微板加樣受試樣品溶液濃度設計：

(7)微板加樣與培養：

(8)數據處理，計算不同濃度下的效應值。

2.根據權利要求1所述的基于青海弧菌Q67的環境污染物長期微板毒性分析法，其特征在于：

(1)青海弧菌Q67普通培養基配制與培養：

分別稱取KH₂PO₄?27.2mg，Na₂HPO₄·12H₂O?71.6mg，MgSO₄·7H₂O?0.5g，MgCl₂·6H₂O?1.22g，CaCl₂?66.0mg，NaHCO₃?2.68g，NaCl?3.08g，酵母浸出膏5.0g，胰蛋白胨5.0g，甘油3.0g，加熱溶解于1000mL蒸餾水中，用1mol/L?NaOH調節pH值至8.5±0.5，按照常規滅菌操作于121℃下高壓蒸汽滅菌20min，即得青海弧菌Q67普通培養基，冷卻后使用或放置于4℃冰箱保存備用；

(2)青海弧菌Q67的固體平板培養基配制：

取步驟(1)所得普通培養基100mL，加入1.5～2.0g瓊脂，加熱使溶解至透明，按照常規滅菌操作經121℃高壓蒸汽滅菌20min，取出后在無菌操作條件下趁熱倒入平板中，每塊平板含前述溶液9～11ml，冷卻后使用或保存于4℃冰箱備用，即得青海弧菌Q67固體平板培養基；

(3)青海弧菌Q67菌種的配制與培養：

取出-20℃保存的青海弧菌典型菌株Q67冷凍干粉100mg，用0.2mL?0.8％NaCl溶液溶解，轉接到一塊步驟(2)所得固體平板培養基上，22±1℃培養48小時長出菌落后，挑取小米粒大小菌落，接種到50mL步驟(1)所得普通培養基中，將所得菌液置于振蕩培養箱，振蕩轉速為每分鐘120轉，溫度保持22±1℃，培養至100μL菌液的相對發光單位達到30萬以上，此時青海弧菌Q67生長進入對數生長期，即得青海弧菌Q67菌種；

(4)青海弧菌Q67微板培養基的配制：

分別稱取KH₂PO₄?27.2mg，Na₂HPO₄·12H₂O?71.6mg，MgSO₄·7H₂O?0.5g，MgCl₂·6H₂O?1.22g，CaCl₂?66.0mg，NaHCO₃?2.68g，NaCl?3.08g，酵母浸出膏8.78g，胰蛋白胨6.63g，甘油6.90g，加熱溶解于1000mL蒸餾水中，利用1mol/L?NaOH調節pH值至8.5±0.5，按照常規滅菌操作于121℃下高壓蒸汽滅菌20min，即得青海弧菌Q67微板培養基，冷卻后使用或于4℃冰箱保存備用；

(5)微板加樣菌液的配制：

將步驟(3)所得的菌種與步驟(4)所得的微板培養基混合均勻，使100μL前述混合液的相對發光強度達到0.8×10⁵～1.2×10⁵相對發光單位，即得微板加樣菌液；

(6)微板加樣受試樣品溶液濃度設計：

污染物的實驗濃度梯度設計方案、測試濃度數量根據不同檢測的要求變化，等比濃度稀釋方案可以檢測更大范圍內污染物的毒性效應，因此，本發明以等比濃度稀釋方案為例，說明微板中樣品濃度設計；采用下列公式n＝1，2，L?12.確定12個受試樣品溶液等比濃度梯度；其中，c₀為樣品儲備液濃度，亦即最高受試樣品溶液濃度c₁；c_n為第n個梯度的受試樣品溶液濃度；根據下列條件確定最高受試樣品溶液濃度和稀釋因子：預實驗確定最高受試樣品溶液濃度下的樣品溶液對微板上青海弧菌Q67發光強度的長期抑制率(即最高抑制率)須達到50％以上，最低受試樣品溶液濃度下的樣品溶液對微板上青海弧菌Q67發光強度的長期抑制率(即最低抑制率)為-5％～+5％；此時，根據最高抑制率時的效應濃度(C_H)與最低抑制率時的效應濃度(C_L)以及需要測試的濃度梯度個數，可以根據下面公式計算得到稀釋因子：污染物的實驗濃度梯度設計方案以及測試濃度數量n均可根據不同檢測的要求而變化；

(7)微板加樣與培養：

取96孔微板，在微板周邊的36個微孔中加入200μL蒸餾水，在剩余的微孔中隨機選取36個微孔作為加樣孔，每3個微孔作為同一受試樣品溶液濃度測定的3個平行組，則可以測定12組不同濃度的受試樣品毒性數據；剩下的微孔則作為空白對照液孔；

在加樣孔中先加入由步驟(6)所制得的受試樣品溶液100μL，隨后在前述加樣孔中再加入由步驟(5)所制得的100μL微板加樣菌液，每個濃度的受試樣品溶液平行加樣3次；在空白對照液孔中先加入100μL蒸餾水，隨后再加入100μL微板加樣菌液；加樣完成后，將微板在22±1℃培養，培養時間≤12小時，培養完成后測定相對發光強度；

同一受試樣品的毒性測定要至少3塊微板的青海弧菌Q67發光抑制實驗；

(8)數據處理：

根據公式(對照組-處理組)/處理組計算抑制效應，其中：處理組為每一受試樣品濃度的3個平行微孔測試所得相對發光強度的平均值，對照組為所有空白對照液孔測試所得相對發光強度的平均值；從而得到受試樣品的濃度-效應數據，對該濃度-效應數據進行非線性最小二乘擬合，得到濃度-效應函數關系，利用反函數進而計算不同濃度下的效應值。