[發明專利]花粉介導的植物基因轉化方法

無效

• 申請號: 201010228315.3
• 申請日: 2010-07-08
• 公開（公告）號: CN102311967A
• 公開（公告）日: 2012-01-11
• 發明（設計）人: 古森本;顏永福
• 申請（專利權）人: 古森本;顏永福
• 主分類號: C12N15/63
• 分類號: C12N15/63;C12N15/87;A01H5/00;A01H5/10
• 代理公司: 北京德琦知識產權代理有限公司 11018
• 代理人: 王琦;王珍仙

技術領域

本發明涉及一種花粉介導的植物基因轉化方法，特別是指一種利用電穿孔法將外源基因導入植物花粉后，再使花粉經由人工授粉產生帶有外源基因的轉化種子，且具有高轉化率的簡易的植物基因轉化方法。

背景技術

分子生物學與組織培養的發展，縮短了植物育種及品種改良的研發過程，通過遺傳工程學的方法，農業科學家可以將對疾病具有抵抗力的基因、增加營養成分的基因等轉化進入作物植株內，以期能栽培出不易因疫病而降低收成量或是提升經濟價值的作物。

目前常用的植物基因轉化方法有利用微注射法(microinjection)、基因槍(gene?gun)、電穿孔(electroporation)等直接將外源基因送至目標細胞的細胞質內的直接法，也有利用載體(例如農桿菌)將外源基因導入植物細胞的間接方法，然而，這些植物基因轉化法都需要經歷冗長的組織培養與再生過程，而且效率不高，目前，大約只有50種植物可以通過這些方法進行基因轉化。

近年有科學家發展出花粉管路徑法(pollen?tube?pathway)，將外源基因附著在花粉(雄配子體)表面以進行授粉，外源基因隨著花粉管進入受精卵，以產生具有外源基因的種子，亦有將植物配子體(gamete)或合子(zygote)做為轉化標的，并將含有轉化基因的配子體或合子進行授粉，以此可省略組織培養的程序，而后亦有人嘗試利用花粉做為外源遺傳物質載體的轉化方法。然而，利用這些方法的轉化成功率大多僅維持1-10％，因此轉化率低為其最大的缺點。

發明內容

本發明的主要目的也就是為了解決上述現有技術中存在的問題，進而提供一種利用電穿孔法直接將外源基因導入植物花粉后，再經由授粉以產生轉化種子且具有高轉化率的植物基因轉化方法，本方法不受植物種類與轉化后可否進行組織培養再生的限制、轉化后的植株不易發生突變且不需藉由組織培養與再生即可獲得具有轉化基因之子代，操作過程亦十分簡單快速。

本發明的花粉介導的植物基因轉化方法是將外源基因與新鮮花粉溶液混合，形成電穿孔(electroporation)制備溶液，對該制備溶液施以特定電壓進行電擊后，花粉壁因電擊作用而產生孔洞，使得外源基因得以導入花粉而產生具有外源基因的轉化花粉，最后利用轉化花粉進行授粉以培育出具有外源基因的種子，該種子萌芽后，即可獲得具有該外源基因的子代植株。

本發明系利用電壓電擊(electroporation)來使花粉壁產生開孔，但電壓太強或孔洞過大時，可能導致花粉的死亡而降低花粉之存活率，進而降低授粉后獲得的種子數，而孔洞過小時，可能使外源基因無法順利導入花粉內而降低外源基因的轉化率，因此，利用本發明方法進行植物基因轉化時，電壓強度及外源基因片段大小皆為重要的影響參數，本發明同時以電擊后之花粉存活率(％)與外源基因導入率(％)作為本發明評估植物基因轉化所需使用的最佳導入電壓的判斷依據，當花粉存活率(％)與外源基因導入率(％)相乘值為最大時的電壓值即為最佳導入外源基因的電壓值。

本發明的方法可使外源基因經由花粉的遺傳物質一起傳至下一代并且進行表達，且轉化率與前人的方法比較可以得到有效的提升，此方法不僅不需要冗長的組織培養與再生過程，任何開花植物都可以適用，而操作過程簡單省時更為本發明的一大優點。

附圖說明

圖1為電擊電壓與花粉存活率和外源基因導入率關系圖。

圖2為花粉存活率染色檢測結果。

圖3為本發明轉化方法所使用的pCAMBIA質粒DNA圖譜。

圖4為外源基因導入率染色檢測結果。

【主要組件符號說明】：

A：不同電擊電壓下花粉存活率。

B：不同電擊電壓下外源基因導入率。

具體實施方式

本發明的花粉介導的植物基因轉化方法，包括下列步驟：

(1)制備新鮮花粉溶液；

(2)構建外源基因；

(3)將該新鮮花粉溶液與該外源基因混合，形成電穿孔制備溶液；

(4)對該電穿孔制備溶液施以電壓進行電擊(electroporation)以形成轉化花粉；及

(5)利用該轉化花粉進行人工授粉以培育具有外源基因的轉化種子。

其中，該外源基因的形態可為質粒、載體或裸露DNA(naked?DNA)。

因花粉在不同電壓電擊下會有不同的存活率(％)，且不同大小片段的外源基因在不同電壓電擊下也會有不同的導入率(％)，該最佳導入電壓即花粉存活率與外源基因導入率的相乘值為最大值時的電擊電壓值。