[發明專利]一種提高無錫他汀產量的方法

無效

• 申請號: 201010225950.6
• 申請日: 2010-07-14
• 公開（公告）號: CN101906446A
• 公開（公告）日: 2010-12-08
• 發明（設計）人: 諸葛斌;牟琳;方慧英;諸葛健
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12P17/06
• 分類號: C12P17/06;C12R1/01
• 代理公司: 北京匯信合知識產權代理有限公司 11335
• 代理人: 王秀麗

技術領域：

本發明涉及一種生產無錫他汀的方法，尤其是一種采用分階段pH控制提高無錫他汀產量的方法，屬于發酵工程技術領域。

背景技術：

隨著生活水平的提高，飲食結構的調整，目前高血脂和冠心病患者數量不斷增加。心血管疾病是一類嚴重危害人類健康的疾病，在世界范圍內其發病率和死亡率始終居高不下，接近世界人口總死亡的1/4，是人類健康的頭號殺手。

他汀類藥物屬于羥甲基戊二酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶抑制劑，為降脂藥物中的首選藥物，也是國內外研究的熱點之一。本實驗在專利號為：200410044893.6，專利名稱為：一種擬無枝酸菌及其生物轉化洛伐他汀為無錫他汀的技術中公開了一種生產無錫他汀的方法，無錫他汀由洛伐他汀經擬無枝酸菌(Amycolatopsis?sp.)CGMCC?NO.1149轉化產生，其抑制作用為洛伐他汀的4倍，是一種新型高效HMG-CoA還原酶抑制劑。

現有的發酵方法是將靜置培養48h的種子液接入轉化培養基中進行菌體培養，48h后加入洛伐他汀至發酵結束。轉化條件自始至終保持不變，最終的底物轉化率不高。本發明通過兩階段pH控制，提高了無錫他汀的產量。

發明內容：

本發明所要解決的技術問題是提供一種提高無錫他汀產量的方法。

為解決上述技術問題，本發明的技術方案為：

以擬無枝酸菌(Amycolatopsis?sp.，保藏編號為CGMCC?NO.1149)為生產菌株，通過兩階段pH控制，提高無錫他汀的產量。

所述兩階段控制包括：階段一pH為7.0-7.5；階段二pH為5.5-6.0。

階段一的發酵條件為：按0.8g/L-1.5g/L的濃度向轉化培養液加入洛伐他汀溶液，30℃發酵20h生成產物I。

階段一最佳pH為7.5。

階段二的發酵條件為：按0.3/L-0.6g/L的濃度向轉化培養液加入產物I，30℃發酵15h生成無錫他汀。

階段二最佳pH為5.5。

轉化培養液的制備：以10％接種量接入轉化培養基中，回轉式搖床150r/min，30℃培養48h。

所述轉化培養基組成為(g/L)：可溶性淀粉50，Hycase?SF?2，玉米漿5，去離子水1000mL。

無錫他汀含量檢測方法：將發酵結束的發酵液離心，微膜過濾后利用HPLC監測樣品，將無錫他汀峰的峰面積代入已有公式(利用標準曲線計算而得)

含量計算公式：

產物含量＝峰面積*樣品稀釋倍數*10^-6/34.606(g/L)

本發明提出了酵生產無錫他汀的方法，通過兩階段pH控制，使無錫他汀的轉化率提高了16％，同時縮短了發酵時間，具有廣闊的應用前景。

附圖說明：

圖1洛伐他汀生物轉化為產物I及無錫他汀的轉化途徑示意圖；

A：洛伐他汀???B：產物I????C：無錫他汀

具體實施方式：

實施例1

將斜面擬無枝酸菌Amycolatopsi?sp.CGMCC?NO.1149接到種子培養基(250mL三角瓶裝50mL)中，28℃靜止培養48h。種子液通過兩層擦鏡紙過濾，將菌絲體過濾除掉，收集的濾液為孢子種子液。按10％的接種量接入轉化培養基，回轉式搖床150r/min，30℃培養48h制備轉化培養液。調轉化培養液pH為7.5，按0.8g/L的濃度向轉化培養液中加入洛伐他汀溶液，轉化20h后將發酵液在4℃下8000rpm離心，取上清液。

將大孔吸附樹脂以適量的95％乙醇充分浸泡24h后，用95％乙醇沖洗至流出液加水(1∶5)不呈渾濁，然后用蒸餾水洗至無醇味。再依次用2％NaOH溶液、蒸餾水、5％HCl溶液沖洗，最后用蒸餾水沖洗至中性，保持分離使用前的狀態。填料裝柱后，先將上清液以1.5BV/h的流速上樣進柱，而洗脫流速為0.8BV/h。先用清水洗去樣液中的大部分色素，再以甲醇含量分別為10％，30％，50％的洗脫液洗去部分雜質，而產物I集中在甲醇含量為60％-70％的洗脫液中，含產物I的洗脫液為無色，其回收率達70％。發酵液中殘留的洛伐他汀則將在甲醇含量達到90％以上時才會被大量洗脫下來。因此收集甲醇含量為60-70％的洗脫液，旋轉蒸發得產物I的濃縮液，并微孔過濾除菌備用。

調新鮮轉化培養液pH至5.5，按0.3g/L的濃度加入提純的產物I，發酵15h。