[發明專利]鴨源性冠狀病毒及其分離培養方法與應用

無效

• 申請號: 201010225577.4
• 申請日: 2010-07-14
• 公開（公告）號: CN101906404A
• 公開（公告）日: 2010-12-08
• 發明（設計）人: 劉興友;姚四新;趙淑秋;劉金華;王憲文;王麗榮;王自良;趙坤;陳仕鈞;趙樸
• 申請（專利權）人: 河南科技學院
• 主分類號: C12N7/00
• 分類號: C12N7/00;A61K39/215;A61K48/00;A61P31/14;A61P11/00;C12R1/93
• 代理公司: 鄭州大通專利商標代理有限公司 41111
• 代理人: 樊羿

技術領域

本發明涉及生物工程領域，具體涉及一種鴨源性冠狀病毒(Avian?infectiousbronchitis?virus，IBV)ZZ2004及其分離培養方法與應用。

背景技術

1937年，冠狀病毒(Coronaviruses)首先從雞身上分離出來。1965年，分離出第一株人的冠狀病毒。由于在電子顯微鏡下可觀察到其外膜上有明顯的棒狀粒子突起，使其形態看上去像中世紀歐洲帝王的皇冠，因此命名為“冠狀病毒”。根據病毒的血清學特點和核苷酸序列的差異，目前冠狀病毒科分為冠狀病毒和環曲病毒兩個屬。冠狀病毒科的代表株為禽傳染性支氣管炎病毒(Avian?infectious?bronchitis?virus，IBV)。該病毒為有囊膜、呈中等多形性球狀或橢圓形的病毒粒子，表面有桿狀突起。

禽傳染性支氣管炎(IB)是由冠狀病毒科的禽傳染性支氣管炎病毒(IBV)引起的一種常見多發的急性高度接觸性傳染病，表現為呼吸型、腎型、腸型、腺胃型等多種病型。該病可感染所有日齡的雞，導致生長遲緩、死亡、增重和飼料報酬降低。IBV往往引起復合感染，如新城疫(Newcastle?Disease，ND)、慢性呼吸道病(CRD)等，并可繼發細菌性疾病，如大腸桿菌病、沙門氏菌病等，從而加重了對雞群的危害。據《世界家禽》1999年資料，全世界的禽病中，以呼吸系統疾病最為嚴重，其中IB是世界大多數地區危害養雞業的主要疾病。1988年以來，IB在我國大部分地區相繼流行，疫區的發病率可達100％，死亡率可達10～30％。國內外已報道的IBV有26種以上血清型，因血清型及新變型眾多，不同血清型之間缺乏交叉保護，新的變異株不斷出現和流行，是造成雞群免疫失敗的原因。這使得IB對養雞業造成的威脅持續存在。而掌握流行毒株的生物學特性和流行特點是正確使用疫苗的前提。

發明內容

本發明要解決的技術問題是分離出了一種變異程度大、對動物的感染譜更廣的鴨源性冠狀病毒ZZ2004，并給出了其分離培養方法與應用。

為解決上述技術問題，本發明采用的技術方案是：

分離出一種鴨源性冠狀病毒(Avian?infectious?bronchitis?virus)ZZ2004，其微生物保藏編號為CGMCC?NO.3842。

上述鴨源性冠狀病毒的一種分離培養方法，包括以下步驟：

(1)在無菌條件下，采集感染IBV并發病的家禽的腎臟、支氣管、法氏囊等組織臟器，加少量滅菌PBS緩沖液反復洗滌2～3次，研磨至乳狀再加少量滅菌PBS稀釋液；

(2)分裝入凍存管，反復凍融2～4次，過濾除菌；

(3)將濾液經尿囊腔接種于9～11日齡SPF雞胚數枚，37℃培養72h，棄去24h內的死胚，無菌條件下收獲尿囊液并連續盲傳5代以上，培養至雞胚表現發育不良，呈蜷縮胚、胚體出血；

(4)對分離毒株不同代次雞胚尿囊液做雞紅細胞凝集試驗，取病變明顯、紅細胞凝集試驗為陰性的雞胚尿囊液；

(4)對分離毒株不同代次雞胚尿囊液做雞紅細胞凝集試驗，取病變明顯紅細胞凝集試驗為陰性的雞胚尿囊液；

(5)取陰性的尿囊液用滅菌PBS作1∶10稀釋，取0.2ml接種于9日齡的SPF雞胚絨毛尿囊腔內，37℃孵化36～48h，置4℃下12h后收獲雞胚尿囊液即可。

在上述步驟(5)之后還包括濃縮步驟：取50ml上述雞胚尿囊液于滅菌的離心管3管，5000rpm離心20min；分別棄沉淀，取上清于另一滅菌的離心管中，12000rpm離心20min；分別棄沉淀，取上清加入50ml的超速離心管，不足的以滅菌PBS補足，40000rpm離心4小時；棄上清液，取沉淀以1ml滅菌PBS懸浮后-20℃保存備用。

上述鴨源性冠狀病毒在制備IBV疫苗中的應用。

鴨源性冠狀病毒ZZ2004可用于制備滅活疫苗、弱毒疫苗、活載體疫苗等常規疫苗，也可以其S1、M、N基因的真核表達質粒pIBVS1、pIBVM、pIBVN，制備IBV質粒DNA疫苗、脂質體/DNA疫苗、殼聚糖/DNA疫苗等。

上述鴨源性冠狀病毒在制備防治雞傳染性支氣管炎藥物中的應用。

本發明具有積極有益的效果：