[發明專利]一種來源于墊狀卷柏的海藻糖-6-磷酸合成酶基因序列及其克隆方法

無效

• 申請號: 201010218665.1
• 申請日: 2010-07-07
• 公開（公告）號: CN101886086A
• 公開（公告）日: 2010-11-17
• 發明（設計）人: 李晚忱;付鳳玲;林荊;牟禹;蔣偉
• 申請（專利權）人: 四川農業大學
• 主分類號: C12N15/52
• 分類號: C12N15/52;C12N15/10;C12N9/00
• 代理公司: 成都九鼎天元知識產權代理有限公司 51214
• 代理人: 劉明芳;吳彥峰

1.一種來源于墊狀卷柏的海藻糖-6-磷酸合成酶基因序列，該序列具有如SEQIDNO.1所述的核苷酸序列。

2.根據權利要求1所述的序列，其特征在于：所述的核苷酸序列對應的氨基酸序列如SEQIDNO.2所述。

3.一種權利要求1所述的來源于墊狀卷柏的海藻糖-6-磷酸合成酶基因序列的克隆方法，包括下述主要步驟：

（1）總RNA的提取和純化：

采用各種通用的RNA提取方法和純化方法，從植物墊狀卷柏葉片中提取得到純化的墊狀卷柏葉片總RNA；

（2）中間片段的克隆：

A、中間片段cDNA第一鏈的合成

以上述步驟（1）純化的墊狀卷柏葉片總RNA作為模板，以oligod(T)18：5’-GCTGTCAACGATACGCTACGTAACGGCATGACAGTG(T)18-3’為反轉錄引物，進行cDNA第一鏈合成，得到的cDNA第一鏈，作為下述步驟B中PCR擴增的cDNA模板；

B、PCR擴增

以前述步驟A所得中間片段的cDNA第一鏈作為cDNA模板，利用下述上游引物jf1和下游引物jx1，進行PCR擴增：

jf1:5’-TGGTCGTAAGGTTATGTTGGG-3’，

jx1:5’-TGTTCGGGCATTGTTGTCAT-3’；

擴增得到墊狀卷柏的海藻糖-6-磷酸合成酶基因cDNA中間片段，通過克隆測序，得到中間片段序列；

（3）3’端的克隆：

以前述步驟（2）A中得到的cDNA第一鏈為模板，利用下述上游引物S1和下游引物AP2進行PCR擴增：

S1:?5’-GCCATCAGAGAAAGCGGTTACT-3’，

AP2:5’-TACGTACGGCATGACAGTG-3’；

擴增得到完整的3’端，通過克隆測序，得到3’端序列；

（4）、5’端的克隆：

C、合成5’端的cDNA第一鏈：

以上述步驟（1）純化的墊狀卷柏葉片總RNA作為模板，以下述下游引物jx1和上游引物SMARTIIAOligo為反轉錄引物，進行反轉錄：

jx1:5’-TGTTCGGGCATTGTTGTCAT-3’，

SMARTIIAOligo:5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACGCGGG-3’；

合成得到反轉錄產物5’端的cDNA第一鏈；

D、第一段PCR擴增：

以前述步驟C所得反轉錄產物5’端的cDNA第一鏈為cDNA模板，利用下述下游引物A2和同源上游引物C1，進行5’端第一段PCR擴增：

A2:5’-TCTTTTCATTTTGACAGGCGAC-3’，

C1：5’-ATCGGATGGCCTGGTGTCTATG-3’；

擴增得到的產物為cDNA5’端第一段，通過克隆測序，得到5’端第一段的序列；

E、第二段PCR擴增：

以前述步驟C所得反轉錄產物5’端的cDNA第一鏈為cDNA模板，利用下述下游引物A5和上游引物P3，進行5’端第二段PCR擴增；

A5:5’-GCGGTCTTCTTGACGCAATCCAATGTAG-3’，

P3:5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3’；

擴增得到的產物為cDNA5’端第二段，通過克隆測序，得到5’端第二段序列；

（5）ORF的克隆和拼接：

將上述步驟（2）所得中間片段序列、步驟（3）所得3’端序列、和步驟（4）所得5’端第一段序列和第二段序列進行拼接，得到的cDNA全長作為ORF擴增的cDNA模板；

以下述上游引物ORF4和下游引物ORF5進行PCR擴增：

ORF4：5’-CCCAAGCTT(HindⅢ)CCTCGAG(XhoⅠ)ATGCCTACTCCGTATTCCAATAC-3’，

ORF5:5’-CGCGGATCC(BamHⅠ)ATTAATTATCGACAGCGACAACC-3’；

擴增得到的產物為完整開放閱讀框，即墊狀卷柏的海藻糖-6-磷酸合成酶基因，通過克隆測序，即得其基因序列。

4.根據權利要求3所述的克隆方法，其特征在于：所述的步驟（1）中，采用的RNA提取方法為Trizol法；純化方法為DNA酶消化法。