[發明專利]一種比法盧定的制備方法

有效

• 申請號: 201010214547.3
• 申請日: 2010-06-28
• 公開（公告）號: CN101906150A
• 公開（公告）日: 2010-12-08
• 發明（設計）人: 白俊才;張若平;劉亞東;張國慶
• 申請（專利權）人: 上海昂博生物技術有限公司
• 主分類號: C07K7/08
• 分類號: C07K7/08;C07K1/06;C07K1/04
• 代理公司: 上海專利商標事務所有限公司 31100
• 代理人: 張睿

技術領域

本發明涉及多肽固相合成領域，尤其涉及比法盧定(Bivalirudin)的固相合成方法。

背景技術

在肽合成的技術方面取得了突破性進展的是R.Bruce?Merrifield，他設計了一種肽的合成途徑并定名為固相合成途徑。首先將一個氨基被封閉基團保護的氨基酸共價連接在固相載體上；在去保護劑的作用下，脫掉氨基的保護基，這樣第一個氨基酸就接到了固相載體上了。然后氨基被封閉的第二個氨基酸的羧基通過試劑活化，羧基被DCC活化的第二個氨基酸再與已接在固相載體的第一個氨基酸的氨基反應形成肽鍵，這樣在固相載體上就生成了一個帶有保護基的二肽。重復上述肽鍵形成反應，使肽鏈從C端向N端生長，直至達到所需要的肽鏈長度。最后脫去保護基，用HF水解肽鏈和固相載體之間的酯鍵，就得到了合成好的肽。多肽合成是一個重復添加氨基酸的過程，固相合成順序一般從C端(羧基端)向N端(氨基端)合成。

凝血酶抑制劑被認為是很有前途的抗血栓藥：通過凝血酶進行的蛋白水解過程是血液凝結控制的關鍵所在。抗凝血肽比伐盧定(bivalirudin)，即所謂的“二價水蛭素(hirulog)”。水蛭素是一種獲自吸血水蛭-醫用水蛭Hirudo?medicinalis的有效治療性凝血酶肽抑制劑，其包含20個氨基酸，屬于強有力的凝血酶直接抑制劑。比伐盧定(bivalirudin)是一種近年來應用于臨床的直接凝血酶抑制劑，于2000年批準在美國上市，其有效抗凝成分為水蛭素衍生物片段，通過直接并特異性抑制凝血酶活性而發揮抗凝作用，作用可逆而短暫。比法盧定可以作為普通肝索和血小板糖蛋白II?b/lI?a拮抗劑的替代藥物應用于非高?；颊叩慕浧す诿}介入治療。

US20070093423A公開了一種多肽固相合成比法盧定的方法，其采用固液相合成方法，將Phe-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly和Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu兩個片段耦合反應形成比法盧定。該方法的成本較高，產生的雜質多，產品純度有限。

US20090062511A公開了一種固相合成比法盧定的方法，其采用固相合成方法，操作繁瑣，產生的雜質多。

因此，本領域迫切需要提供一種多肽固相合成比法盧定的新方法，其成本低廉、得到的比法盧定純度高，可以有效去除HPLC主峰前、后的[Bivalirudin-Gly](即Bivalirudin少一Gly)和[Bivalirudin+Gly](即Bivalirudin多一Gly)雜質。

發明內容

本發明旨在提供一種多肽固相合成比法盧定(Bivalirudin)的制備方法。

本發明提供了一種比法盧定(Bivalirudin)的制備方法，所述的方法包括步驟：

(1)在縮合劑存在下，將Fmoc-Asn(Trt)-Gly-OH和如式V所示的多肽樹脂縮合，得到如式III所示的多肽樹脂；

(2)將如式III所示的多肽樹脂和去保護劑混合，除去Fmoc保護基；

(3)在縮合劑存在下，將Fmoc-Gly-Gly-Gly-Gly-OH和如式VI所示的多肽樹脂縮合，得到如式IV所示的多肽樹脂；

(4)通過固相合成的方法將氨基酸自C端向N端按照Pro至Arg至Pro至Phe的順序依次同如式IV所示的多肽樹脂上的多肽縮合，形成如式II所示的多肽樹脂；和

(5)在切割劑的存在下，使式II所示多肽樹脂上的多肽和樹脂分離，得到如式I所示的比法盧定；

其中，所述的Fmoc-Asn(Trt)-Gly-OH通過下述步驟得到：

(i)將Z-Asn(Trt)-OH和H-Gly-OBzl.TosOH混合，進行液相多肽縮合，得到Z-Asn(Trt)-Gly-OBzl；

(ii)將Z-Asn(Trt)-Gly-OBzl進行氫化還原，得到H-Asn(Trt)-Gly-OH；和

(iii)將H-Asn(Trt)-Gly-OH和Fmoc保護基混合，得到Fmoc-Asn(Trt)-Gly-OH。

所述的Fmoc-Gly-Gly-Gly-Gly-OH通過下述步驟得到：

(a)將H-Gly-Gly-OBzl和Z-Gly-Gly-OH混合，進行液相多肽縮合，得到Z-Gly-Gly-Gly-Gly-OBzl；