[發明專利]一種新型鏈霉菌分泌表達質粒及應用無效

申請號：	201010196933.4	申請日：	2010-06-10
公開（公告）號：	CN102002510A	公開（公告）日：	2011-04-06
發明（設計）人：	洪斌;朱元軍;王麗非;杜郁;余騰斐;王松梅	申請（專利權）人：	中國醫學科學院醫藥生物技術研究所
主分類號：	C12N15/76	分類號：	C12N15/76;C12N1/21;C12P21/00;C12R1/465
代理公司：	中國國際貿易促進委員會專利商標事務所 11038	代理人：	程泳
地址：	100050***	國省代碼：	北京;11
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摘要：
搜索關鍵詞：	一種新型霉菌分泌表達質粒應用
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【說明書】：

技術領域

本發明涉及分子生物學以及基因工程領域，具體而言，涉及一種鏈霉菌分泌表達質粒，以及其在鏈霉菌中分泌表達外源蛋白的應用。

背景技術

鏈霉菌是一種絲狀革蘭氏陽性細菌，能產生大量的次級代謝產物，如抗生素、免疫抑制劑等，在醫藥和農業生產中具有重要的價值。鏈霉菌表達體系是從20世紀中后期發展起來的一種新的原核表達體系，具有高效的蛋白分泌機制，并且表達的蛋白通常是可溶性、具有生物活性的，這些優點使其成為一種非常有前景的表達體系。

模式菌天藍色鏈霉菌的基因組測序已經完成，變鉛青鏈霉菌(Streptomyces?lividans)也已成為一個高效分泌異源蛋白的表達宿主，許多真核蛋白在該系統中獲得了成功的分泌表達，如TNFα、鮭魚降鈣素(Vrancken?K，Ann?éJ，Secretory?production?of?recombinantproteins?by?Streptomyces，Future?Microbiology，2009，4(2)：181-188)等。

到目前為止根據不同的需要已經在鏈霉菌中構建了大量的質粒載體(Kieser?T，Bibb?MJ，Buttner?MJ，Chater?KF，Hopwood?DA：PracticalStreptomyces?Genitics，2000)，其中大部分是從變鉛青鏈霉菌ISP5434質粒pIJ101衍生而來。雖然鏈霉菌的克隆表達體系已逐漸完善，但是向鏈霉菌中直接引入外源基因仍然比大腸桿菌復雜，并且能達到大腸桿菌表達水平的載體還很少。

研究人員在1992年從力達霉素產生菌球孢鏈霉菌C-1027(Streptomyces?globisporus?C-1027)中分離出一種新質粒pSGL1(李曉平，李元，中國抗生素雜志，1992，17(5)：326～332)，該質粒具有易于分離，分子量小(7.4kb)和帶有多個限制性酶切位點的特點。進一步的研究表明，pSGL1為高拷貝質粒，其最小復制子位于Sau3AI酶切的2.0kb片段上(洪斌，李元，球孢鏈霉菌質粒pSGL1的性質研究，微生物學報，1998，38(4)：256-260；張華，洪斌，李元，鏈霉菌質粒pSGL1最小復制子序列測定及分析，微生物學報，1999，39(4)：327-332)，而且該質粒與常用的pIJ101衍生質粒相容，可用于異源基因的克隆和表達。但是該質粒現在還沒有充分優化，不含大腸桿菌質粒復制子和接合轉移元件oriT，只能采用原生質體轉化的方式來進行鏈霉菌中外源基因的克隆，操作比較繁瑣；沒有方便實用的多克隆位點來克隆需要表達的外源基因；沒有外源基因表達必需的啟動子；沒有外源基因分泌表達必需的信號肽。因此尚需要進一步開發簡便易用、表達效率高的鏈霉菌表達載體。

發明內容

基于此需要，發明人進行了多方面的研究，選擇了力達霉素產生菌球孢鏈霉菌C-1027中的表達元件，由此構建了能在鏈霉菌中進行重組蛋白表達的新型載體。

本發明的一個方面涉及一種表達載體，其為環狀，且可操作地連接有：

源于pSGL1的復制子序列：其由SEQ?ID?NO：1中第5086-7372位所示序列的互補序列構成；

大腸桿菌復制起始區ori序列：其由SEQ?ID?NO：1中第2497-3164位所示序列構成；

氨芐青霉素抗性基因bla序列：其由SEQ?ID?NO：1中第3315-4172位所示序列的互補序列構成；

多克隆酶切位點序列：其由SEQ?ID?NO：1中第1452-1481位所示序列構成；

阿普霉素抗性基因aac(3)IV序列：其由SEQ?ID?NO：1中第204-980位所示序列的構成；

源于鏈霉菌接合轉移的必需區oriT序列：其由SEQ?ID?NO：1中第8602-8713位所示序列構成；

cagAp和ermE*p串聯的強啟動子序列：其由SEQ?ID?NO：1中第1581-2057位所示序列的互補序列構成；和

信號肽序列：其由SEQ?ID?NO：1中第1482-第1580位所示序列的互補序列構成或者由SEQ?ID?NO：1中第1482-第1580位所示序列中第1572位至第1574位的CTG替換為TTA的互補序列構成。

本發明另一方面涉及一種表達載體，其為環狀，且由SEQ?ID?NO：1所示序列構成。