[發(fā)明專利]一種體外重組神經(jīng)氨酸酶的細胞定位方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201010187625.5
• 申請日: 2010-05-28
• 公開（公告）號: CN101899462A
• 公開（公告）日: 2010-12-01
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 李碧春;任麗偉;田智泉;徐琪;常國斌;孫敏;王霄燕;陳國宏
• 申請（專利權(quán)）人: 揚州大學(xué)
• 主分類號: C12N15/62
• 分類號: C12N15/62;C12N15/85;C12Q1/02;G01N21/64
• 代理公司: 南京知識律師事務(wù)所 32207
• 代理人: 盧亞麗

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及重組蛋白在細胞中的分布及功能分析領(lǐng)域，具體涉及一種體外重組神經(jīng)氨酸酶的細胞定位方法。

技術(shù)背景

神經(jīng)氨酸酶(neuraminidase，NA)是構(gòu)成流感病毒胞膜刺突的一個重要蛋白成分。蛋白質(zhì)的亞細胞定位是蛋白質(zhì)功能研究的重要方面，研究發(fā)現(xiàn)，NA蛋白在細胞水平上的抗病活性與其亞細胞定位有關(guān)。研究NA蛋白的細胞亞定位對該蛋白抗病功能及其抗病機理的研究具有重要的意義。

從目前蛋白定位研究來看，方法主要是免疫組織化學(xué)染色技術(shù)，它是應(yīng)用免疫學(xué)基本原理-抗原抗體反應(yīng)，對組織或細胞內(nèi)抗原或者抗體物質(zhì)定性和定位的組織化學(xué)技術(shù)。但該技術(shù)是一種多步驟、多因素決定的實驗方法，有很多干擾因素，無論是組織取材、固定、制片、抗原暴露及修復(fù)、液體及抗體的配制、修復(fù)溫度、顯色等等因素都會影響免疫組織化學(xué)染色，對試驗結(jié)果造成直接的影響。而綠色熒光蛋白目前作為一種熒光標記基因，利用基因工程技術(shù)，將該基因整合于感興趣蛋白cDNA一端使其融合表達蛋白，應(yīng)用熒光顯微鏡可方便、快捷的檢測到目的基因的表達，從而減少了實驗步驟，加快了實驗進展。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明目的是提供一種體外重組神經(jīng)氨酸酶的細胞定位方法，該方法能簡捷、直觀檢測外源基因在細胞水平上的表達位置。

本發(fā)明所說的體外重組神經(jīng)氨酸酶的細胞定位方法，可通過以下三個具體步驟來實現(xiàn)：

步驟一：將神經(jīng)氨酸酶基因的cDNA(Genebank登錄號：EU429718.1，具體序列如SEQ?NO.1所示)。連接進真核表達載體pcDNA3.0，構(gòu)建pcDNA3.0-NA載體，然后再將增強型綠色熒光蛋白(EGFP)基因連接至pcDNA3.0-NA載體上，構(gòu)建融合表達載體pcDNA3.0/EGFP-NA；

步驟二：將含有綠色熒光蛋白(EGFP)基因與神經(jīng)氨酸酶的融合表達載體pcDNA3.0/EGFP-NA轉(zhuǎn)染NIH-3T3細胞；

步驟三：轉(zhuǎn)染細胞48h后，熒光倒置顯微鏡下可觀察綠色熒光在細胞水平上的表達位置，以此可確定神經(jīng)氨酸酶在細胞中亞定位情況。

由于神經(jīng)氨酸酶具有酶切活性，可以酶切去掉細胞表面的唾液酸受體，使細胞免受粘病毒(如：禽流感病毒、新城疫病毒等)的侵染。把某一亞型的NA基因cDNA構(gòu)建表達載體導(dǎo)入小鼠3T3(NA-)細胞系中構(gòu)建能夠永久表達NA基因的轉(zhuǎn)基因細胞系，細胞水平上的抗病毒實驗表明，NA具有一定的抗病毒活性。

NIH-3T3細胞株是從小鼠胎兒里得到培養(yǎng)建立的，由于它顯示出強烈的接觸抑制作用，所以能明確地識別已發(fā)生轉(zhuǎn)染的細胞。該細胞自身不能合成并表達NA蛋白，同時能在體外環(huán)境中長期的穩(wěn)定培養(yǎng)，因此能夠作為一種重要的細胞材料滿足于生物醫(yī)學(xué)研究的需要。并且經(jīng)實驗表明，連接在一起的增強型綠色熒光蛋白(EGFP)基因-NA蛋白基因能在NIH-3T3細胞中正常翻譯，因此，本發(fā)明利用增強型綠色熒光蛋白基因與NA基因構(gòu)建融合表達載體pcDNA3.0/EGFP-NA，該載體在NIH-3T3細胞獲得表達，通過檢測融合表達蛋白在細胞水平上的表達位置，建立了快速、簡捷定位神經(jīng)氨酸酶的方法。

附圖說明

圖1：pMD-19T-NA載體構(gòu)建圖

圖2：pcDNA3.0-NA載體結(jié)構(gòu)圖

圖3：融合表達載體pcDNA3.0/EGFP-NA結(jié)構(gòu)圖

圖4：熒光倒置顯微鏡下觀察EGFP-NA融合蛋白在NIH-3T3細胞中明場(a)、暗場(A)分布

具體實施方式：