[發(fā)明專利]一種枯草芽孢桿菌脂肪酶及制備方法和應(yīng)用

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201010187107.3
• 申請(qǐng)日: 2010-05-25
• 公開（公告）號(hào): CN101838634A
• 公開（公告）日: 2010-09-22
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張先恩;周亞鳳;王曉英;張治平;王殿冰;危宏平;崔宗強(qiáng)
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)科學(xué)院武漢病毒研究所
• 主分類號(hào): C12N9/20
• 分類號(hào): C12N9/20;C12N15/57;C14C5/00
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務(wù)所 42001
• 代理人: 王敏鋒

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及分子酶工程學(xué)與生物技術(shù)，具體涉及一種高活力脂肪酶的編碼基因，同時(shí)涉及該突變基因編碼的脂肪酶蛋白的制備方法。高酶活脂肪酶突變株蛋白可以廣泛應(yīng)用于食品、化工和醫(yī)藥等行業(yè)。

背景技術(shù)

脂肪酶(Lipase，E.C.3.1.1.3)是催化油脂水解的一類酶的總稱。按照國(guó)際生化聯(lián)合會(huì)的原則，它的系統(tǒng)名稱為三脂酰甘油?；饷?triacylglycerolacylhydrolase)，習(xí)慣稱為脂肪酶。脂肪酶在動(dòng)植物的各種組織及微生物中普遍存在，是生物體內(nèi)脂代謝不可缺少的重要水解酶。脂肪酶屬于α/β折疊酶家族，是一種絲氨酸水解酶。脂肪酶的催化遵循絲氨酸水解酶的反應(yīng)機(jī)制，能夠在油水界面上將甘油三酯完全水解成脂肪酸和甘油，因而脂肪酶能夠催化脂水解、脂合成和脂交換等多種反應(yīng)，被應(yīng)用于油脂處理、洗滌劑、食品加工、精細(xì)化工、制藥、造紙等多種行業(yè)。

脂肪酶是研究得最早的酶類之一。人們于1834年首先在動(dòng)物胰臟發(fā)現(xiàn)脂肪酶的活性，至今已有近二百年的歷史。1871年報(bào)道了植物種子脂肪酶，而上世紀(jì)初人們從微生物中也發(fā)現(xiàn)了脂肪酶。由于微生物脂肪酶種類多，具有比動(dòng)植物脂肪酶更廣的反應(yīng)pH值、反應(yīng)溫度以及對(duì)底物的反應(yīng)專一性，又便于進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)和獲得高純度的酶制劑，再加上微生物脂肪酶在理論研究和實(shí)際應(yīng)用中都非常重要，因此它們?cè)谘芯亢蛻?yīng)用上的進(jìn)展相當(dāng)迅速。產(chǎn)脂肪酶的微生物種類很多，遍及細(xì)菌、酵母及霉菌各大類中，迄今已經(jīng)報(bào)道的65個(gè)屬中，細(xì)菌28個(gè)屬，放線菌4個(gè)屬，酵母菌10個(gè)屬，其它真菌23個(gè)屬。迄今為止，黑曲霉、白地霉、毛霉、熒光假單胞菌等所產(chǎn)生的脂肪酶已經(jīng)相繼獲得結(jié)晶。其它如無根根霉、圓柱形假絲酵母、耶爾氏球擬酵母、粘質(zhì)色桿菌等來源的脂肪酶也相繼得到高度提純，并對(duì)它們的理化性質(zhì)開展了進(jìn)一步的研究。

盡管產(chǎn)脂肪酶微生物容易發(fā)現(xiàn)，但尋找適合于工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)的脂肪酶產(chǎn)生菌及其發(fā)酵條件卻非常困難。在通過傳統(tǒng)誘變育種以及優(yōu)化發(fā)酵條件提高脂肪酶產(chǎn)量方面已經(jīng)開展了大量的工作，并使得許多脂肪酶實(shí)現(xiàn)了工業(yè)化生產(chǎn)。近年來隨著基因操作技術(shù)的深入發(fā)展和應(yīng)用，人們能夠越來越多的通過直接對(duì)酶基因的改造，獲得更適合于生產(chǎn)實(shí)踐需求的脂肪酶制劑。在眾多的脂肪酶中，枯草桿菌脂肪酶Lip?A作為一種細(xì)菌來源的脂肪酶，具備許多優(yōu)良的性質(zhì)，如分子量小，催化活力高，底物范圍廣，是一種嗜堿性脂肪酶等，因此其具有較好的食品工業(yè)及化學(xué)工業(yè)等方面的應(yīng)用潛力。但是，由于枯草桿菌脂肪酶高濃度時(shí)容易聚集，給其純化和應(yīng)用帶來很大困難，所以通過改造Lip?A，得到高酶活突變株，使其在低濃度范圍就具有高催化活性，具有重大意義。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是在于提供了一種高酶活脂肪酶突變株蛋白的編碼基因LipA(R33W/L140F)，具有SEQ?ID?NO.1所示的核苷酸序列以及所述的序列編碼的突變酶，該突變酶具有SEQ?ID?NO.2所示的氨基酸序列。通過重疊PCR引入突變，連接于表達(dá)載體，獲得高活力脂肪酶產(chǎn)生菌(Escherichia?coli)BL21/pET28a-Lip?A?f₁₂-C₂(R33W/L140F)，生產(chǎn)高活力突變體脂肪酶。該突變酶的酶活是野生型的四倍。

本發(fā)明的另一個(gè)目的是在于提供了一種枯草芽孢桿菌脂肪酶的制備方法，該方法是構(gòu)建大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，利用親和層析方法純化高酶活脂肪酶突變株蛋白。該方法簡(jiǎn)便，成本低廉。

本發(fā)明的再一個(gè)目的是在于提供了一種高酶活脂肪酶突變株蛋白在皮革加工工業(yè)中的應(yīng)用。在皮革加工中的浸水和/或浸灰工藝中添加該蛋白可以水解并分散皮革中的脂肪，使油脂分子變小、水溶性增強(qiáng)而達(dá)到皮革脫脂的目的。本發(fā)明提供的突變體蛋白對(duì)不同碳鏈長(zhǎng)度的底物的催化活性是野生型的4倍以上，應(yīng)用于皮革脫脂時(shí)，在保證相同催化功效的前提下，與野生型酶制劑相比可以有效減少酶制劑的使用量，不但可以節(jié)約成本，同時(shí)可以避免脂肪酶高濃度應(yīng)用容易發(fā)生聚集而降低催化效率的問題，提高皮革的脫脂效果。

為了實(shí)現(xiàn)上述任務(wù)，本發(fā)明采用以下技術(shù)措施：

本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種核苷酸序列，該序列編碼一種高酶活脂肪酶突變株蛋白，具有SEQ?ID?NO.1所示的核苷酸序列，其特征是在于野生型脂肪酶結(jié)構(gòu)基因上具有97位的C突變?yōu)門(R33W)，420位的A突變?yōu)門(L140F)的點(diǎn)突變。一種高酶活脂肪酶突變株蛋白的制備方法，其步驟是：

1.突變脂肪酶LipA(R33W/L140F)突變點(diǎn)的引入：